Блок управления эпхх: Блок управления ЭПХХ 5003.3761

Содержание

Блок управления ЭПХХ 5003.3761

 

Общие сведения:

Блок управления экономайзером принудительного холостого хода (ЭПХХ) 5003.3761 предназначен для включения/отключения электромагнитного клапана ЭПХХ с целью повышения экономии топлива и снижения токсичности выхлопных газов автомобиля.

Применяемость: автомобили ВАЗ-2108, ВАЗ-2109, «Таврия» и др.

Блок управления ЭПХХ 5003.3761 обеспечивает:
— управление электромагнитным клапаном экономайзера принудительного холостого хода;
— защиту цепи управления клапаном экономайзера от короткого замыкания на “массу” автомобиля;
— защиту от понижения сопротивления цепи клапана ЭПХХ.

Блок управления ЭПХХ выпускается в климатическом исполнении О2.1 по ГОСТ 15150 для внутреннего рынка и на экспорт. Режим работы блока по ГОСТ 3940 — продолжительный, номинальный S1.

Блок 5003.3761 устанавливается на предусмотренное для него место в автомобиле при помощи штатных крепежных деталей и штатного разъема.

Гарантийный срок эксплуатации — 3 года с даты ввода в эксплуатацию или со дня продажи в розничной торговой сети. Гарантийные обязательства производителя имеют силу в течение четырех лет с даты выпуска изделия. Дата изготовления нанесена на корпусе изделия.

 

Технические данные:

  Номинальное напряжение питания, В

12,0

  Допустимые пределы напряжения питания, В

6,0 . . 18,0

  Максимальный ток коммутации, А

1,0 ± 0,2

 
Частота вращения коленчатого вала 4-тактного 4-цилиндрового двигателя, об/мин (Гц):
 
   — соответствующая включению клапана ЭПХХ

1900 ± 96  (63,3 ± 3,2)

   — соответствующая выключению клапана ЭПХХ

2100 ± 105 (70,0 ± 3,5)

  Превышение частоты выключения клапана ЭПХХ над частотой включения (гистерезис), об/мин (Гц), не менее

200 (6,67)

  Максимально допустимое воздействие повышенного напряжения питания до 5 мин.
, В

25,0

  Максимально допустимые перенапряжения положительной и отрицательной полярности, В

160,0

 

 

Схема включения:

 

 

Габаритный чертеж:

 

Cхема электрическая принципиальная:

50133761 Блок управления ЭПХХ ВАЗ-21213 СОЛЕКС АЭНК-К — 5013.

3761
50133761 Блок управления ЭПХХ ВАЗ-21213 СОЛЕКС АЭНК-К — 5013.3761 — фото, цена, описание, применимость. Купить в интернет-магазине AvtoAll.Ru Распечатать

4

1

Артикул: 5013.3761

Код для заказа: 103685

Есть в наличии

Доступно для заказа4 шт.Данные обновлены: 10.06.2021 в 01:30

Код для заказа 103685 Артикулы 5013.3761 Производитель Калужский завод электронных изделий Каталожная группа: . .Электрооборудование
Электрооборудование
Ширина, м:
0.045 Высота, м: 0.04 Длина, м: 0.1 Вес, кг: 0.04 Применяемость по марке машин: ВАЗ (LADA) Блоки управления: экономайзеры

Отзывы о товаре

Сертификаты

Обзоры

Наличие товара на складах и в магазинах, а также цена товара указана на 10. 06.2021 01:30.

Цены и наличие товара во всех магазинах и складах обновляются 1 раз в час. При достаточном количестве товара в нужном вам магазине вы можете купить его без предзаказа.

Интернет-цена — действительна при заказе на сайте или через оператора call-центра по телефону 8-800
-600-69-66. При условии достаточного количества товара в момент заказа.

Цена в магазинах — розничная цена товара в торговых залах магазинов без предварительного заказа.

Срок перемещения товара с удаленного склада на склад интернет-магазина.

Представленные данные о запчастях на этой странице несут исключительно информационный характер.

095cda4c8b00e8623d790b3ef968c9df

Добавление в корзину

Доступно для заказа:

Кратность для заказа:

Добавить

Отменить

Товар успешно добавлен в корзину

!

В вашей корзине на сумму

Закрыть

Оформить заказ

Блок управления ЭПХХ 4-х контактное К-151(25.

3761)
Блок управления электроблокировки дверей (замков)Блок управления ЭПХХ 6-ти контактное ДААЗ (УАЗ-4178)


Увеличить

Внимание! Фотография носит исключительно ознакомительный характер и может отличатся от товара, фактически имеющегося на складе.

Номенклаторный номер: 3741-00-3733000-00
Позвоните, чтобы уточнить цену
наличие в магазинах:
База: нет

Для управления клапаном ЭПХХ в карбюраторных двигателях автомобилей используется блок управления ЭПХХ 25.3761.
Для включения и отключения электромагнитного клапана экономайзера принудительного холостого хода карбюратора К151.
Система ЭПХХ (управления экономайзером принудительного холостого хода) служит для снижения расхода топлива и токсичности отработавших газов. Система состоит из электро-пневмоклапана, блока управления и микровыключателя. Боковой штуцер электропневмоклапана соединен трубкой с пневмоклапаном экономайзера принудительного холостого хода в карбюраторе, а центральный штуцер — с патрубком впускной трубы. Микро выключатель установлен на кронштейне карбюратора, элек-тропневмоклапан и блок управления — на моторном щите.
Работает система так. Блок управления непрерывно контролирует частоту вращения коленчатого вала двигателя. При частоте врашения 1500 мин-1±5% и закрытой дроссельной заслонке (режим принудительного холостого хода) блок управления отключает электропневмоклапан, его внутренняя полость сообщается с атмосферой, и связанный с ним пневмоклапан экономайзера карбюратора перекрывает подачу топлива в систему холостого хода. При снижении частоты вращения коленчатого вала двигателя до 1245 мин-1±5% блок управления включает электропневмоклапан, и подача топлива в систему холостого хода возобновляется. При открытой дроссельной заслонке подачу напряжения к электропневмоклапану обеспечивает микровыключатель, на рычажок которого воздействует плечо рычага привода дроссельной заслонки.

Неисправность системы ЭПХХ проявляется в рывках автомобиля при движении с малой скоростью, остановках двигателя в режиме холостого хода или вспышках в цилиндрах двигателя после выключения зажигания.
Для проверки блока управления системой ЭПХХ на холостом ходу увеличиваем частоту вращения коленчатого вала до 1500 мин-1 и снимаем привод с одного из выводов микровыключателя. При исправном блоке управления обороты коленчатого вала начнут «плавать» в пределах 1200-1500 мин-1 , при неисправном — останутся стабильными. Для проверки пневмоклапана экономайзера карбюратора при работе двигателя на холостом ходу отсоединяем от его штуцера трубку — двигатель должен остановиться. Неисправный пневмоклапан заменяем
Для проверки электролневмоклапана на работающем двигателе отсоединяем провод от одного из его контактов. При исправном пневмоклапане экономайзера карбюратора двигатель должен остановиться в течение 1-2 с. Если двигатель продолжает работать, электропневмоклапан следует заменить.



Мнения покупателей:
Еще нет мнений об этом товаре.
Пожалуйста, войдите, чтобы оставить свое мнение.


Изменено: Среда, 09 Июнь 2021 23:57

Блок управления ЭПХХ Солекс ВАЗ 2101-2107, НИВА 2121 ВТН (5013.3761) (вкл 1700, выкл 1900)

Блок управления экономайзером принудительного холостого хода (ЭПХХ) 5013.3761 предназначен для включения/отключения электромагнитного клапана ЭПХХ с целью повышения экономии топлива и снижения токсичности выхлопных газов автомобиля.

Применяемость: автомобили ВАЗ-2104, ВАЗ-2105, ВАЗ-2107, ВАЗ-2121 и др. с карбюратором “Солекс”.

Блок управления ЭПХХ 5013.3761 обеспечивает:
— управление электромагнитным клапаном экономайзера принудительного холостого хода;
— защиту цепи управления клапаном экономайзера от короткого замыкания на “массу” автомобиля* ;
— защиту от понижения сопротивления цепи клапана ЭПХХ*.

Блок управления ЭПХХ выпускается в климатическом исполнении О2.1 по ГОСТ 15150 для внутреннего рынка и на экспорт. Режим работы блока по ГОСТ 3940 — продолжительный, номинальный S1.

Блок 5013.3761 устанавливается на предусмотренное для него место в автомобиле при помощи штатных крепежных деталей и штатного разъема.
Технические данные:

  Номинальное напряжение питания, В

12,0

  Допустимые пределы напряжения питания, В

6,0 . . 18,0

  Максимальный ток коммутации, А

1,0 ± 0,2

  Частота вращения коленчатого вала 4-тактного 4-цилиндрового двигателя, соответствующая:  
  — включению клапана ЭПХХ, об/мин (Гц)

1709 ± 85,5
(56,9 ± 2,85)

  — выключению клапана ЭПХХ, об/мин (Гц)

1900 ± 96
(63,3 ± 3,2)

  Превышение частоты выключения клапана ЭПХХ над частотой включения (гистерезис), об/мин (Гц), не менее

191 (6,37)

  Максимально допустимое воздействие повышенного напряжения питания длительностью до 5 мин. , В

25,0

  Максимально допустимые импульсные перенапряжения положительной и отрицательной полярности, В

160,0


Проверка блока управления и клапана ЭПХХ

Проверка блока управления и клапана ЭПХХ

 

Кроме вышеперечисленных элементов система питания содержит блок управления ЭПХХ и электромагнитный клапан, установленные в подкапотном пространстве. Совместно с пневмоклапаном и микровыключателем, установленным на карбюраторе, эти устройства образуют систему ЭПХХ, отключающую подачу топлива в режиме принудительного холостого хода и предотвращающую работу двигателя от самовоспламенения после выключения зажигания.

Оба устройства неразборной конструкции и при выходе из строя подлежат замене.

Проверка исправности электромагнитного клапана проводится непосредственно на автомобиле. Для этого нужно при работающем двигателе снять со штекера клапана любой из проводов. Двигатель должен немедленно остановиться. Продолжающаяся работа двигателя при исправных системах карбюратора и пневмоклапане ЭПХХ указывает на неисправность электромагнитного клапана.

Для проверки исправности блока управления ЭПХХ следует подключить вольтметр к проводу, соединяющему электромагнитный клапан с блоком управления, и к «массе». На холостом ходу и при повышенной частоте вращения коленвала двигателя напряжение на штекере электромагнитного клапана должно быть выше 12 В. Затем, увеличив частоту вращения коленвала двигателя до 2000-3000 мин-1, следует резко закрыть дроссельную заслонку. В момент закрытия дроссельной заслонки и до снижения частоты вращения до 1100 мин-1 напряжение на штекере электромагнитного клапана должно отсутствовать. Если напряжение при отпускании дроссельной заслонки остаётся неизменным, следует отсоединить любой провод от микровыключателя системы ЭПХХ карбюратора. Если при частоте вращения коленвала двигателя более 1600-1800 мин-1 фиксируется падение напряжения до 0,5 В и ниже, то в микровыключателе короткое замыкание или нарушена его установка. Если напряжение не падает – неисправен блок управления. Косвенно эта неисправность подтверждается работой двигателя от самовоспламенения после выключения зажигания.

 

Система управления экономайзера принудительного холостого хода

При движении автомобиля в городе, двигатель около 25 % времени работает на принудительном холостом ходу, когда коленчатый вал двигателя вращается за счет кинетической энергии автомобиля и он движется с включенной передачей и отпущенной педалью управления дроссельной заслонкой. В таких режимах двигатель управляется с помощью экономайзера принудительного холостого хода. 

Система управления экономайзера принудительного холостого хода УАЗ, блок управления, клапан, микровыключатель.

На принудительном холостом ходу двигатель расходует топливо, не выполняя полезную работу, в результате быстрого закрытия дроссельной заслонки горючая смесь переобогащается и токсичность отработавших газов увеличивается. Для снижения расхода топлива и токсичности отработавших газов на автомобилях УАЗ установлена электрическая система управления экономайзера принудительного холостого хода (ЭПХХ).

Система управления и электрооборудование экономайзера принудительного холостого хода на автомобилях УАЗ с двигателями УМЗ включает в себя блок управления 1422.3733, электромагнитный клапан 1902.3741 и концевой выключатель карбюратора (микровыключатель) 421.3709.

Принцип работы системы управления экономайзера принудительного холостого хода на автомобилях УАЗ.

Режим принудительного холостого хода характеризуется двумя признаками : частота вращения коленчатого вала двигателя больше частоты холостого хода и дроссельная заслонка карбюратора закрыта. Информация о частоте вращения коленчатого вала двигателя поступает в блок управления ЭПХХ с датчика, в качестве которою используется первичная обмотка катушки зажигания, а информация о закрытии дроссельной заслонки — с концевого выключателя, микровыключателя или датчика-винта карбюратора.

Схема соединений электрооборудования экономайзера принудительного холостого хода на автомобилях УАЗ.

При отпускании педали акселератора, в следствии переключения контактов концевого выключателя карбюратора блок управления ЭПХХ вырабатывает сигналы управления электромагнитным (электропневматическим) клапаном подачи топлива в зависимости от частоты вращения коленчатого вала двигателя. Если частота вращения коленчатого вала выше частоты холостого хода, то блок управления снимает напряжение с электроклапана, и подача топлива в двигатель прекращается.

При этом частота вращения коленчатого вала снижается, и когда она станет меньше частоты холостого хода, блок управления подключит напряжение бортовой сети к электроклапану. Подача топлива возобновится и частота вращении коленчатого вала возрастет.

При частоте вращения коленчатого вала, снова ставшей больше частоты холостого хода, блок управления опять отключит электроклапан. Процесс повторяется. Периодической отключение подачи топлива в этом режиме снижает расход бензина на 2-3%, а токсичность отработавших газов уменьшается на 15-30%

При нажатии на педаль акселератора контакты концевого выключателя карбюратора переключаются таким образом, что на электроклапан будет постоянно подаваться напряжение бортовой сети. Топливо при этом будет подаваться независимо от частоты вращения коленчатого вала двигателя.

Блок управления 1422.3733 экономайзера принудительного холостого хода на автомобилях УАЗ, принцип работы.

На автомобилях УАЗ с двигателями УМЗ применяются четырехштырьковые блоки управления 1422.3733 экономайзера. В качестве датчик положения дроссельной заслонки используется микровыключатель 421.3709. При закрытой дроссельной заслонке импульсы напряжения пропорциональные частоте вращения коленчатого вала, поступают с первичной обмотки катушки зажигания 1 на вход полупроводникового ключа, собранного на транзисторе VT1.

Принципиальная схема блока управления 1422.3733 экономайзера принудительного холостого хода на автомобилях УАЗ с двигателями УМЗ.

Во время действия импульса ключ открывается и конденсатор СЗ разряжается. В паузах между импульсами конденсатор СЗ заряжается. Время заряда, а следовательно, и напряжение на СЗ увеличивается с уменьшением частоты вращения коленчатого вала. При частоте больше частоты холостого хода напряжение на СЗ мало, транзисторы VT2, VT4, VT5, VT6 закрываются. На электромагнитный (электропневматический) клапан напряжение не подается.

Клапан закрывается и подача топлива прекращается. Частота вращения коленчатого вала падает. При частоте меньше частоты холостого хода конденсатор СЗ во время паузы между импульсами успевает зарядиться до напряжения, превышающего опорное напряжение порогового элемента, собранного на транзисторах VT2, VT4. Транзисторы VT2 и VT4 при этом открываются, что обеспечивает открытие транзисторов VT5 и VT6. На электропневмоклапан при этом подается напряжение.

Клапан срабатывает и включает подачу топлива. При открытии дроссельной заслонки контакты микропереключателя S1 замыкаются и напряжение бортовой сети постоянно поступает на электропневмоклапан. Клапан постоянно открыт независимо от сигналов блока управления 1422.3733 экономайзера принудительного холостого хода.

Похожие статьи:

  • Регуляторы напряжения РР350 и РР132А, характеристики, устройство и принцип действия.
  • Генераторы Г250-Е1 и Г250-П2 на УАЗ-469 и УАЗ-3151, характеристики, устройство и принцип действия.
  • Датчики уровня жидкостей и снижения давления в контуре тормозов, устройство, принцип действия, проверка исправности.
  • Контактная система зажигания УАЗ, состав и общее устройство, схемы контактной системы зажигания.
  • Указатель температуры охлаждающей жидкости 14.3807 и датчик ТМ100, проверка и диагностика неисправностей.
  • Указатель давления масла 15.3810 и датчик давления ММ358, проверка исправности, основные характеристики.

Система автоматического управления экономайзером легковых автомобилей назначение и принцип работы

Рис. 1 Схема блока управления 25.3761 САУЭПХХ автомобилей ВАЗ моделей 2105 и 2107

САУЭПХХ автомобилей ВАЗ моделей 2105 и 2107 предназначена для работы с карбюратором ДААЗ-2105 «Озон». Система состоит из блока управления 25.3761, электромагнитного клапана 1902.3741 и микровыключателя 421.3709.

В отличие от САУЭПХХ грузовых автомобилей у легковых автомобилей подача топлива на режиме принудительного холостого хода прерывается не непосредственно электромагнитным клапаном, а иглой ЭПХХ, перемещение которой осуществляется пневматической системой, управляемой электромагнитным клапаном.

Блок управления 25.3761 (рис. 1) заставляет систему перекрыть подачу топлива в двигатель, если частота вращения коленчатого вала двигателя превышает 1500 об/мин и дроссельная заслонка закрыта. Импульсы от системы зажигания поступают через вывод Х4, входной делитель R1, R2, диод VD1 и конденсатор С2 на транзистор VT1. Ток зарядки конденсатора С2 открывает транзистор VT1, а тот, в свою очередь, открывая путь для протекания тока базы транзистора VT2, переводит его в открытое состояние. Биполярные транзисторы VT1 и VT2 будут открыты, пока конденсатор С3 полностью не разрядится. Сразу после этого вступает в действие схема преобразования частоты вращения вала двигателя в напряжение.

Конденсатор С3 заряжается через резисторы R4, R5 до напряжения -тем большего, чем больше промежуток времени между импульсами зажигания. Напряжение конденсатора СЗ подается на вход компаратора, собранного на транзисторах VT3 и VT4. На другой вход компаратора, которым является вывод базы транзистора VT3, подается опорное напряжение с резисторов R9, R10. Это напряжение составляет часть напряжения питания схемы, стабилизированного стабилитроном VD2. На выход компаратора подключена база транзистора VT6.

Сигнал на выходе компаратора появляется только тогда, когда напряжение на эмиттере транзистора VT3 превысит напряжение на его базе, т. е. когда напряжение на конденсаторе СЗ будет больше опорного напряжения. Это произойдет, если частота вращения вала двигателя станет меньше порогового значения. При этом транзистор VT3 откроется, что, в свою очередь, приведет к открытию транзистора VT4, и появлению на резисторе R12 выходного напряжения компаратора. Это напряжение сместит переход база — эмиттер VT6 в прямом направлении, и транзистор VТ6 открывается.

При переходе транзистора VTб в открытое состояние открываются и транзисторы VT7, VT8. При этом конденсатор С7 заряжается и ток его зарядки кратковременно открывает транзистор VT9.

При открытых транзисторах VT9, VT8 становится возможно протекание через их переходы коллектор — эмиттер тока базы транзистора VT10 и переход составного транзистора VT10 и VT11 в открытое состояние.

Если в цепи электромагнитного клапана У А существует короткое замыкание (цепь, подходящая к выводу X1, замкнута на массу), то составной транзистор закроется после зарядки конденсатора С7, что предохранит его от перегрузки. Если же цепь нагрузки функционирует нормально, то открытый составной транзистор через переход эмиттер — коллектор транзистора VT11 и резистор R21 подключает базу транзистора VT9 к сети питания, чем обеспечивает самоблокировку схемы. При этом транзистор VT9 и составной транзистор VT10, VT11 остаются во включенном состоянии, соединяя вывод X1 штекерного разъема с выводом «+» сети. Резисторы R15, R16 совместно с транзистором VT5 образуют жесткую обратную связь. При открывании транзистора VT11 открывается и транзистор VT5, и параллельно резистору R10 подключается цепь резисторов R15, R16.

Опорное напряжение снижается, обеспечивая гистерезис в работе блока управления; напряжение на его выходе вновь появляется при уменьшении частоты вращения вала до 1100 об/мин (у блока 252.3701 до 1200 об/мин). Гистерезис в работе блока управления- вызывает более четкое его срабатывание. Следовательно, если частота вращения вала двигателя не достигла порогового значения, на выходном штекере X1 блока управления САУЭПХХ имеется напряжение, приблизительно равное напряжению сети питания. Это напряжение заставляет электропневмоклапан УА при «всех положениях дроссельной заслонки находиться во включенном состоянии. Под действием разряжения во впускном трубопроводе, подводимого к игле ЭПХХ через включенный электропневмоклапан, игла отжимается и открывает свободный доступ топливу по каналу системы холостого хода.

При частоте вращения вала двигателя автомобиля выше порогового значения напряжение на выходе блока управления пропадает. Если при этом дроссельная заслонка полностью закрыта, то обмотка электропневмоклапана обесточивается и по цепи микровыключателя S1 так как рычаг привода заслонки выключит его с отключением электропневмоклапана. После этого разряжение, отжимающее иглу ЭПХХ, пропадает и игла перекрывает доступ топлива к двигателю. Открытие дроссельной заслонки и снижение частоты вращения вала двигателя вновь приводят к включению электропневмоклапана и восстановлению доступа топлива в цилиндры.

Конструкция блока управления 25.3761 аналогична конструкции блока 1102.3761. Монтаж схемы блока 25.3761 выполнен на печатной плате. При этом часть схемы изготовлена в виде интегральных микросхем DAI, DA2 и DA3. Печатная плата вставлена в пластмассовый корпус. Крышка блока приклеена к его корпусу, что делает конструкцию блока управления неразборной.

Электропневмоклапан 1902.3741 неразборный и ремонту не подлежит. В комплекте с электропневмоклапаном 1902.3741 работают и электронные блоки управления САУЭПХХ 1402.3733 автомобилей ЗАЗ-968М, УАЗ-469, а также 1422.3733 микроавтобусов РАФ-22038. Эти блоки отличаются один от другого только настройкой на пороговую частоту срабатывания. Блок 1402.3733 прерывает подачу напряжения на электропневмоклапан при частоте вращения коленчатого вала двигателя выше 1700 об/мин и вновь подводит к нему напряжение при частоте вращения ниже 1400 об/мин. У блока 1422.3733 эти значения в среднем на 450 об/мин ниже.

В САУЭПХХ автомобилей ВАЗ-2108 используется электронный блок управления 50.3761. Блок получает информацию о частоте вращения через вывод X1 с первичной обмотки катушки зажигания и через вывод Х5 от микровыключателя, управляемого дроссельной заслонкой карбюратора 2108-1107010. Питание подводится к блоку через выводы X1 и Х2, вывод Х6 соединен с электромагнитным клапаном. Блок отключает напряжение от электромагнитного клапана и прерывает подачу топлива при частоте вращения выше 2100 об/мин и замыкании на массу вывода Х5 через микровыключатель. Напряжение на клапане появляется при снижении частоты вращения ниже 1900 об/мин. На некоторых автомобилях ВАЗ-2108 может быть установлена САУЭПХХ, имеющая дополнительный микровыключатель, управляемый педалью сцепления, включенный последовательно с микровыключателем карбюратора. Такая система перекрывает доступ топлива, когда не нажаты ни педаль сцепления, ни педаль подачи топлива. Блок управления в этом случае имеет пороговую частоту срабатывания на 400—500 об/мин меньше, чем в системе с одним микровыключателем.

Техническое обслуживание ремонт системы автоматического управления экономайзером

Электронные блоки САУЭПХХ регулируют на заводе-изготовителе и в эксплуатации не подлежат регулированию. Обслуживания они также не требуют, следует лишь периодически наблюдать за надежностью штекерного соединения. В случае выхода из строя блок заменяют новым.

Электромагнитные клапаны также не требуется обслуживать, их разборка не допускается.

В процессе эксплуатации следует удалять смолистые отложения с помощью органических растворителей, не разрушающих резину, например, с помощью бензина. После промывки органическим растворителем внутреннюю полость клапана 1902.3741 следует продуть чистым воздухом.

Проверку электронных блоков можно осуществить измерением частот вращения коленчатого вала двигателя, соответствующих резкому изменению напряжения на зажимах, предназначенных для подключения электромагнитного клапана. Эти частоты определяются сначала при плавном увеличении, а затем снижении частоты вращения вала двигателя. У блоков 1102.3761 и 50.3761 такая проверка должна сопровождаться замыканием на массу вывода, идущего к микровыключателю. При проверке электронных блоков других типов провода от микровыключателей должны быть отсоединены. Проверку блока 1102.3761 следует проводить на прогретом двигателе. Измеренные частоты вращения должны соответствовать пороговым частотам срабатывания блока.

Клапаны проверяют подключением их к аккумуляторной батарее. Если при этом слышен характерный щелчок, значит клапаны работают.

Общим диагностическим признаком отказа САУЭПХХ служит останов двигателя на режиме холостого хода.

Первичное повреждение ДНК и генетический полиморфизм CYP1A1, EPHX и GSTM1 у рабочих завода по производству графитовых электродов

BMC Public Health. 2007; 7: 270.

, 1 , 2 , 1 , 3 , 2 , 3 и 1

Massimo Moretti

1 Отделение медико-хирургического профиля Общественное здравоохранение, Университет Перуджи, Via del Giochetto, 06122 Perugia, Italy

Marco Dell’Omo

2 Институт медицины труда и токсикологии Университета Перуджи, Via E.dal Pozzo, 06126 Перуджа, Италия

Милена Вильярини

1 Кафедра медико-хирургических специальностей и общественного здравоохранения, Университет Перуджи, Via del Giochetto, 06122 Перуджа, Италия

Роберта Пасторелли

Департамент окружающей среды 3 Медицинские науки, Istituto di Ricerche Farmacologiche «Mario Negri», Via Eritrea 62, 20157 Милан, Италия

Giacomo Muzi

2 Институт медицины труда и токсикологии Университета Перуджи, Via E. dal Pozzo, 06126 Перуджа, Италия

Луиза Аирольди

3 Департамент гигиены окружающей среды, Istituto di Ricerche Farmacologiche «Mario Negri», Via Eritrea 62, 20157 Милан, Италия

Rossana Pasquini

1

1 Медико-хирургические специальности и общественное здравоохранение, Университет Перуджи, Via del Giochetto, 06122 Перуджа, Италия

1 Кафедра медико-хирургических специальностей и общественного здравоохранения, Университет Перуджи, Via del Giochetto, 06122 Перуджа, Италия

2 Институт медицины труда и токсикологии Университета Перуджи, Via E.dal Pozzo, 06126 Перуджа, Италия

3 Департамент гигиены окружающей среды, Istituto di Ricerche Farmacologiche «Mario Negri», Via Eritrea 62, 20157 Милан, Италия

Автор, отвечающий за переписку.

Поступило 18 июня 2007 г .; Принято 1 октября 2007 г.

Авторские права © 2007 Moretti et al; лицензиат BioMed Central Ltd.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), что разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Резюме

Предпосылки

Результаты поперечного исследования были направлены на оценку наличия генетических полиморфизмов (биомаркеров восприимчивости) для генов CYP1A1 , EPHX и GSTM1 , которые влияют на активацию и детоксикацию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). могут влиять на степень первичного повреждения ДНК (биомаркер биологически эффективной дозы) у рабочих, подвергшихся воздействию ПАУ.Воздействие ПАУ на исследуемые популяции оценивали путем определения концентрации 1-гидроксипирена (1OHP) в образцах мочи (биомаркер экспозиционной дозы).

Методы

Облученная группа состояла из рабочих (n = 109) завода по производству графитовых электродов, профессионально подвергавшихся воздействию ПАУ. 1OHP в моче измеряли с помощью ВЭЖХ. Первичное повреждение ДНК оценивали с помощью щелочного анализа комет в лейкоцитах периферической крови. Генетический полиморфизм для CYP1A1 , EPHX и GSTM1 определяли с помощью ПЦР или ПЦР / ПДРФ-анализа.

Результаты

Повреждения 1OHP и первичной ДНК были значительно выше у рабочих, работающих с электродами, по сравнению с контрольными субъектами. Более того, отнесение субъектов к нормальным или резко отклоняющимся показателям выявило повышенный риск генотоксичности OR = 2,59 (ДИ 95% 1,32–5,05), связанный с воздействием ПАУ. Полиморфизм в экзонах 3 и 4 EPHX был связан с более высокими концентрациями 1OHP в моче, в то время как ни один из проанализированных генотипов ( CYP1A1 , EPHX и GSTM1 ) не оказал значительного влияния на первичное повреждение ДНК, по оценке кометный анализ.

Заключение

Результаты настоящего исследования показывают, что молекулярные эпидемиологические подходы (т. Е. Перекрестные исследования биомаркеров генотоксичности) могут играть роль в выявлении общих генетических факторов риска, также пытаясь связать эффекты с измеренными данными воздействия. Более того, категоризация субъектов как нормальных или резко отклоняющихся позволила оценить связь между профессиональным воздействием ПАУ и повреждением ДНК, подчеркнув повышенный риск генотоксичности.

Предпосылки

Графитовые электроды используются в металлургической промышленности, в основном при производстве стали в электродуговых печах, для рафинирования стали в ковшовых печах и в других плавильных процессах [1].Процесс производства графитовых электродов включает использование каменноугольной смолы, каменноугольного пека и нефтяного кокса. Рабочие могут подвергаться воздействию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) при вдыхании (ПАУ, как летучих, так и связанных с вдыхаемыми твердыми частицами) и при контакте с кожей [2] . Профессиональное воздействие на рабочих летучих веществ каменноугольного пека, содержащего ПАУ, пека и кокса, происходит во время производственного процесса, особенно при нагревании сырья [3-6]. Профессиональное воздействие ПАУ было связано с повышенным риском развития рака легких, кожи, мочевого пузыря и простаты среди рабочих, производящих графитовые электроды [2,7-10].

Несколько сотен ПАУ были охарактеризованы по их химическому составу, и многие индивидуальные ПАУ ( например, бензо [a] пирен, бензо [a] антрацен, дибензо [a, h] антрацен) рассматриваются как вероятно или возможно канцерогенные для человека. Международное агентство по изучению рака (группа 2A или 2B) [11]. Канцерогенная активность ПАУ связана с повреждающей активностью ДНК некоторых из их метаболитов, которые могут ковалентно связываться с нуклеофильными остатками оснований ДНК. ПАУ активируются до соответствующих электрофильных диолепоксидов (высших канцерогенов) через ферментную систему цитохрома P450 (CYP) [12].Инактивация метаболитов диалепоксида происходит в основном за счет конъюгации с восстановленным глутатионом (GSH) ферментами глутатион S -трансфераза (GST) [13].

Было обнаружено, что многие гены, кодирующие ферменты, метаболизирующие канцерогены, полиморфны у людей, имеют отношение к индивидуальной реакции на канцерогены, вероятно, действуя как модификаторы биомаркеров воздействия (маркеры восприимчивости) [14-16].

Критическим полиморфным геном, который способствует биоактивации многих ПАУ, является CYP1A1 , кодирующий фермент цитохрома P4501A1 (CYP1A1), индуцибельный фермент с активностью арилгидроксилазы.Среди нескольких полиморфизмов, идентифицированных в гене CYP1A1 , две тесно связанные мутации были тщательно изучены в отношении риска рака. Мутация CYP1A1 Ile / Val ( m2 ) в гем-связывающей области удваивает активность микросомального фермента, и она находится в неравновесном сцеплении у кавказцев с мутацией CYP1A1 Msp I ( m1 ), которая также была экспериментально связаны с повышенной каталитической активностью [17]. Сообщалось о положительных ассоциациях между присутствием этих вариантных аллелей и повышенными аддуктами ПАУ-ДНК [18-20].

Еще одним важным ферментом в метаболизме ПАУ является микросомальная эпоксидгидролаза (mEH), которая катализирует гидролиз эпоксидов до дигидродиолов и, как таковая, играет важную роль в детоксикации токсичных, высокореактивных промежуточных продуктов, образующихся в реакциях, опосредованных цитохромом P450 [ 21]. Низкая активность мЭГ была связана с побочными реакциями на лекарства или заболеваниями [22]. Были идентифицированы два полиморфных сайта в гене mEH ( EPHX ). Замена в кодоне 113 (Tyr → His) в экзоне 3 связана со снижением активности mEH, тогда как замена в кодоне 139 (His → Arg) в экзоне 4 связана с повышенной активностью mEH.Эти мутации влияют на активность фермента mEH, изменяя стабильность белка, не влияя на удельную активность [23].

Ген GSTM1 кодирует цитозольный фермент глутатион S -трансферазу μ1 (GSTM1), который выводит токсины из активированных форм химических канцерогенов, таких как полиароматические углеводородные эпоксиды. Этот ген удален примерно у 50% жителей европеоидной расы с вариациями от 38 до 65% [24]. Унаследованное отсутствие гена GSTM1 (нулевой генотип GSTM1 ) теоретически связано с более высоким риском токсического воздействия химических веществ, и его влияние на различные биомаркеры воздействия широко изучалось [18, 25–27]. .

В данной статье мы сообщили о результатах перекрестного исследования, направленного на оценку того, могут ли генетические полиморфизмы (биомаркеры восприимчивости) для генов CYP1A1 , EPHX и GSTM1 , которые влияют на активацию и детоксикацию ПАГ, влиять на степень первичного повреждения ДНК (биомаркер биологически эффективной дозы) у рабочих, подвергшихся воздействию ПАУ ( n = 109) и в контрольной группе, не подвергавшейся воздействию ( n = 82). Воздействие ПАУ на исследуемые популяции оценивали путем определения концентрации 1-гидроксипирена (1OHP) в образцах мочи (биомаркер экспозиционной дозы).Концентрация в моче 1OHP, метаболита неканцерогенного ПАУ пирена, является хорошо подтвержденным маркером воздействия ПАУ [28], дающим точную оценку общего воздействия ПАУ при всех путях воздействия [29]. Степень первичного повреждения ДНК оценивали с помощью кометного анализа лейкоцитов периферической крови (PBL) [30]. Субъекты исследования были генотипированы на полиморфизм в гене CYP1A1 (мутации, связанные с повышенной каталитической активностью), кодирующем фермент цитохрома P4501A1, в гене EPHX (мутации, влияющие на активность фермента mEH), кодирующем фермент mEH, и Ген GSTM1 (унаследованное отсутствие), кодирующий цитозольную глутатион S -трансферазу μ1 (GSTM1).

Методы

Исследуемая популяция и сбор образцов

Всего в исследовании участвовал 191 здоровый мужчина, проживающий в том же районе Центральной Италии. Группа, подвергшаяся воздействию, состояла из 109 рабочих на заводе по производству графитовых электродов, подвергшихся профессиональному воздействию ПАУ. Электродный завод производит большие электроды (длина 2,5 ÷ 3 м, диаметр до 1 м) и мелкие кирпичи (диаметром менее 0,1 м) из электродной пасты для сталелитейной промышленности [3]. В качестве контрольной группы из технического и обслуживающего персонала Университета Перуджи было набрано 82 эталонных субъекта (не подвергавшихся профессиональному воздействию ЛАГ).

Были опрошены рабочие и референтные субъекты для получения личных данных и информации о текущей работе, привычке к курению, потреблению алкоголя, диете, а также текущем и прошлом состоянии здоровья (включая информацию о приеме лекарств, рентгеновских обследованиях и вирусных инфекциях). После получения информированного согласия от всех лиц, включенных в исследование, рабочие и контрольные субъекты предоставили образец мочи для определения 1OHP и образец периферической венозной крови (с использованием гепаринизированных пробирок Vacutainer) для анализа комет и генотипирования. Биологические пробы были собраны у рабочих в конце смены после не менее 4 дней работы подряд. Образцы были закодированы и сразу же доставлены в лабораторию в холодильных ящиках.

Протокол исследования был одобрен этическим комитетом Университета Перуджи.

CYP1A1 , EPHX и GSTM1 Генотипирование

Тотальную ДНК экстрагировали из клеток периферической крови с использованием стандартных методов. Все генотипы определяли после амплификации генов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [31].Мутация T → C ( m1 ) в 3′-фланкирующей области гена CYP1A1 была обнаружена с помощью ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с использованием рестрикционного фермента Msp I [32]. Генотип w 1 / w 1 (без сайта Msp I) образует нерасщепленную полосу длиной 340 п.н., тогда как генотип m 1 / m 1 (гомозиготен по аллелю, несущему мутацию с Сайт Msp I) генерирует две полосы по 200 и 140 п. н.Гетерозиготный генотип m 1 / w 1 соответствует трем полосам из 340, 200 и 140 п.н.

Замещение CYP1A1 Ile / Val ( м2 ) было обнаружено с помощью анализа Bsr DI-RFLP [33]. Полиморфизм Ile / Val возникает в результате изменения основания A → G, приводящего к замене изолейцина валином по остатку 462 в гем-связывающей области фермента. Вариант аллеля Val демонстрирует почти в два раза более высокую каталитическую ферментативную активность, чем форма Ile.

Ампликоны экзонов 3 и 4 гена EPHX (162 и 381 п.н. соответственно) были получены с помощью ПЦР, затем были выполнены RFLP-расщепления для определения генотипов экзона 3 (Tyr113His) и экзона 4 (His139Arg) с использованием рестрикционные ферменты EcoR V и Rsa I соответственно [31]. На основе полиморфизмов в кодоне 113 (экзон 3) и 139 (экзон 4) гена EPHX субъекты были классифицированы в соответствии с ожидаемой активностью фермента mEH (низкая mEH, промежуточная mEH или высокая mEH активность) [31] .

GSTM1 генотипирование на предмет делеций гена проводили путем обнаружения присутствия или отсутствия интактного гена [34]. Отсутствие продуктов амплификации, специфичных для GSTM1 , выявило соответствующий нулевой генотип (гомозиготная делеция гена GSTM1 , приводящая к дефициту активности GSTM1). Положительный генотип GSTM1 , обнаруженный по присутствию GSTM1 -специфической полосы длиной 215 п.н., содержал гомозиготы и гетерозиготы дикого типа для делеции (не дифференцированные в анализе), оба экспрессирующие фермент GSTM1.Коамплификацию гена β-глобина использовали в качестве внутреннего контроля (наличие в образце амплифицируемой ДНК).

Анализ 1-гидроксипирена в моче

Концентрации 1OHP в моче определяли с помощью ВЭЖХ в ферментативно гидролизованных образцах мочи [28]. Образцы мочи, доведенные до pH 5,0, обрабатывали в течение ночи при 37 ° C β-глюкуронидазой и арилсульфатазой, а затем очищали твердофазной экстракцией с помощью картриджей Sep-Pack C18, заправленных метанолом. Затем картриджи промывали водой высокой чистоты и 1OHP элюировали метанолом.Элюат осторожно упаривали досуха в атмосфере азота и восстанавливали в метаноле. Из восстановленного элюата 15 мкл вводили в ВЭЖХ, и 1OHP, элюирующий при времени удерживания 8 мин, детектировали с длинами волн возбуждения и испускания 347 и 388 нм, соответственно.

Анализ первичного повреждения ДНК (анализ комет) в лейкоцитах

PBL были получены из цельной крови путем лизиса эритроцитов [35]. Жизнеспособность клеток после выделения определяли с помощью теста жизнеспособности, опосредованного флуорохромом (одновременное окрашивание диацетатом флуоресцеина и йодидом пропидия) [36].Изолированные PBL были обработаны в тесте на кометы в соответствии со стандартным щелочным протоколом [37] с небольшими изменениями [38,39].

Клетки (2 × 10 5 ) смешивали с 0,7% агарозой с низкой температурой плавления (общий объем 75 мкл / предметное стекло) и помещали между слоем 0,5% агарозы с нормальной температурой плавления (75 мкл) и верхним слоем 0,7% низкотемпературной агарозы (65 мкл) на обычные предметные стекла. Лизис клеточных и ядерных мембран внедренных клеток проводили путем погружения слайдов на 60 мин при 4 ° C в темноте в ледяной свежеприготовленный раствор для лизиса (10 мМ трис-HCl, 1% натрия N — лауроилсаркозинат, 2.5 M NaCl, 100 мМ Na 2 EDTA, 1% тритон X-100 и 10% ДМСО; pH 10). Предметные стекла удаляли из раствора для лизиса и затем помещали в горизонтальный бокс для электрофореза. Устройство заполняли свежеприготовленным щелочным буфером (300 мМ NaOH, 1 мМ Na 2 EDTA; pH> 13) до уровня 0,25 см над предметными стеклами. Чтобы обеспечить раскручивание ДНК и проявление неустойчивых к щелочам повреждений, внедренные клетки подвергали воздействию щелочи в течение 20 минут, затем проводили электрофорез в том же буфере в течение 20 минут, прикладывая электрическое поле 25 В (1 В / см) и регулируя ток до 300 мА.

Для контроля условий анализа, в частности процедуры подготовки слайдов и эффективности электрофореза, отрицательные и положительные внутренние контроли (клетки Jürkat, лимфобластоидные Т-клетки человека) обрабатывали параллельно с образцами цельной крови. Клетки Jürkat не обрабатывали (отрицательный контроль) или инкубировали в течение 1 ч с 1 мкг / мл 4-нитрохинолин- N -оксида (положительный контроль). Электрофорез считался действительным только в том случае, если внутренний контроль дал ожидаемые результаты.

После электрофореза слайды сначала осторожно промывали 0,4 М трис-HCl буфером (pH 7,5) для нейтрализации щелочи, а затем ДНК окрашивали, добавляя 100 мкл бромистого этидия (2 мкг / мл). Предметные стекла хранили в увлажненном герметичном боксе для предотвращения высыхания геля и анализировали в течение 48–72 часов.

Кометы в каждом геле анализировали (вслепую) при 500-кратном увеличении с использованием эпифлуоресцентного микроскопа (возбуждающий фильтр, 515–560 нм; барьерный фильтр, 590 нм), оборудованного высокочувствительной черно-белой камерой CCD.Для каждого субъекта определяли среднюю длину хвоста, интенсивность хвоста и значения момента хвоста, оценивая 150 комет (50 комет / слайд, по крайней мере, из трех повторяющихся слайдов). Визуализацию проводили с использованием специализированной системы анализа («Comet Assay III», Perceptive Instruments).

Статистический анализ данных

Анализы проводили с использованием пакета статистических программ SPSS 10.0 (SPSS Inc., IL, США). Для каждого субъекта в качестве точки данных при анализе данных использовались усредненные масштабы миграции (т.е. длина хвоста, интенсивность хвоста и момент хвоста) 150 проанализированных клеток.Клетки также были классифицированы как «неповрежденные» или «поврежденные» с учетом пороговых уровней, указывающих на клетки с хвостом аномального размера (AST) (, т.е. 95-й процентиль распределения параметров хвоста среди контролей) [40]. Клетки со значениями параметров хвоста ниже порогового значения (18,87 мкм, 16,73% и 1,90 для длины хвоста, интенсивности хвоста и момента хвоста, соответственно) были классифицированы как «неповрежденные», а клетки с более высокими значениями — как «поврежденные». На основании этих бинарных результатов каждый субъект был классифицирован как «нормальный» или «выпадающий» с учетом верхней границы ожидаемого числа AST, которое было рассчитано для каждого субъекта из биномиального распределения [41]. Последняя переменная результата (т.е. каждый субъект, определяемый как нормальный или выпадающий) снова является бинарным, становясь субъектом статистической единицей.

Групповые различия в концентрации 1OHP и степени первичного повреждения ДНК (отдельные усредненные параметры хвоста) были протестированы с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни U (двусторонний). Тест равновесия Харди-Вайнберга для распределения генотипов выполняли с использованием критерия χ 2 с 1 степенью свободы. Генотип GSTM1 был закодирован как положительный (гомозиготы и гетерозиготы дикого типа для делеции) или нулевой (гомозиготная делеция), что делало невозможным прямой расчет равновесия Харди-Вайнберга.Критерий Пирсона-χ 2 был использован для определения значимых различий в распределении выбывающих субъектов и частот аллелей рассматриваемых генотипов между группами. Отношение шансов (ОШ) распространенности резко выделяющихся субъектов с 95% доверительным интервалом (95% ДИ) было рассчитано с помощью перекрестной таблицы. Уровень статистической значимости был установлен на уровне p <0,05.

Результаты

Характеристики исследуемой популяции

Демографические характеристики исследуемой популяции, также сгруппированные в соответствии со статусом воздействия и привычками к курению, представлены в таблице.Что касается возраста и привычек курения, подвергшиеся воздействию и контрольные группы были сопоставимы. Экспонированные рабочие и контрольная группа были стратифицированы по генотипам: CYP1A1 Msp I ( m1 ), CYP1A1 Ile / Val ( м2, ), EPHX и GSTM1 (таблица). Аналогичное частотное распределение (критерий Пирсона-χ 2 ) наблюдалось в группах для рассматриваемых генотипов. Что касается гена CYP1A1 , 38 (20,2%) субъектов оказались гетерозиготными по мутантному аллелю Msp I, 27 (24.8%) подверглись воздействию рабочих и 11 (13,8%) контрольных. 5 (2,6%) гомозиготных особей Msp I, 3 (2,8%) рабочих и 2 (2,5%) контрольных группы были объединены с гетерозиготными субъектами для последующего статистического анализа. В группе из 189 обследованных мужчин мутантный аллель Val для гена CYP1A1 встречался у 17 (9,0%) лиц, 11 (10,1%) подвергшихся воздействию рабочих и 6 (7,5%) контрольных групп. Только 1 (0,5%) человек (контрольный субъект) оказался носителем гомозиготного Val / Val варианта CYP1A1 и был объединен с гетерозиготными индивидуумами для статистического анализа.Около 50% обследованных субъектов (94 человека) показали низкую предполагаемую активность mEH (, т.е. определение активности mEH на основании результатов генотипирования полиморфизмов EPHX в экзонах 3 и 4), 59 (54,1%) подверглись рабочих и 35 (43,8%) контрольных. Остальные 95 субъектов (50,3%), 50 (45,9%) рабочих, подвергшихся воздействию, и 45 (56,2%) контрольных групп, показали среднюю / высокую предполагаемую активность мЭГ. Вышеуказанные генотипы (например, CYP1A1 Msp I ( m1 ), CYP1A1 Ile / Val ( м2, ), EPHX ) среди экспонированных и контрольных субъектов находились в равновесии Харди-Вайнберга (данные не показаны) . Во всей исследуемой популяции распространенность GSTM1 нулевых субъектов составляла 82 (43,4%), из которых 46 (42,2%) подвергались воздействию и 36 (45,0%) контрольных лиц. Только 21 (11,1%) субъект были носителями GSTM1 null + CYP1A1 w 1 / m 1 + m 1 / m 1 комбинированного генотипа, 13 (11,9%) подвергались воздействию и 8 ( 10,0%) контрольные; 10 (5,3%) субъектов представили GSTM1 null + CYP1A1 w 2 / m 2 + m 2 / m 2 комбинированный генотип, 5 (4.6%) подвергались воздействию и 5 (6,3%) контрольные; 9 (4,8%) человек были носителями восприимчивого GSTM1 null + CYP1A1 w 1 / m 1 + m 1 / m 1 + CYP1A1 w 2 / m 2 + m 2 / m 2 генотипа, 5 (4,6%) подвергшихся воздействию и 4 (5,0%) контрольных.

Таблица 1

Демографические характеристики исследуемой популяции, сгруппированные в соответствии со статусом воздействия.

32 ± 0,56
Открытые работники Органы управления
Субъекты 109 82
Демографические характеристики a 42,99 ± 0,73
≤ 40 лет 34 30
> 40 лет 75 52
Срок службы 9039 занятость b 14,34 ± 8,05
≤ 10 лет 36
> 10 лет 73
Некурящие 54 42
Курильщики 55 40
Сигареты в день

94 c. 85 ± 9,14
14,92 ± 8,11

Таблица 2

Распределение генотипов CYP1A1 , EPHX и GSTM1 у экспонированных и контрольных субъектов. Данные представлены в виде количества субъектов (процентное соотношение в скобках).

Генотип Открытые рабочие Контроли a
CYP1A1 ( Msp I) b w1 / 72.5) 67 (83,8)
w1 / m1 + m1 / m1 30 (27,5) 13 (16,3)
CYP1A1 (IleA1 Val ) c w2 / w2 98 (89,9) 73 (91,3)
w2 / м2 + м2 / м2 11 (10,1) 7 (8,8)
EPHX d Низкая 59 (54. 1) 35 (43,8)
Средний + Высокий 50 (45,9) 45 (56,3)
GSTM1 Активный 63 (57,8) 44 (553,0)
Нулевой 46 (42,2) 36 (45,0)

Влияние воздействия на биологические конечные точки

Статистически значимые корреляции были обнаружены между тремя различными параметрами, измеряющими степень повреждения ДНК в лейкоцитах (i .е. длина хвоста, интенсивность хвоста и момент хвоста), таким образом, представление данных будет ограничено интенсивностью хвоста, также принимая во внимание, что относительная интенсивность хвоста (процент ДНК, мигрировавшей в хвосте кометы) считается наиболее полезным параметром, поскольку он имеет линейная зависимость от частоты разрывов цепей и относительно не зависит от настроек пороговых значений в компьютеризированной системе анализа [42].

Групповые средние значения (± SEM) 1OHP в моче, индивидуальный средний процент ДНК, мигрировавшей в хвосте кометы ( i.е. интенсивности хвоста) и количество AST приведены в таблице; доли субъектов с отклонениями в экспериментальной и контрольной группах (, т.е. интенсивности хвоста) и значения OR показаны в таблице.

Таблица 3

Концентрация 1-гидроксипирена (1OHP) в моче и степень первичного повреждения ДНК в лейкоцитах периферической крови у рабочих и контрольных лиц. Данные представлены как средние значения группы (± SEM) индивидуума: концентрация 1OHP в моче (выраженная как мкг 1OHP / г креатинина), усредненные значения интенсивности хвоста (% ДНК, мигрировавшей в хвосте кометы, оценивается в 150 клетках) и количество AST .

9039 905 0,17
1OHP Повреждение ДНК

Всего 2,64 ± 0,29 * 5,28 ± 0,21 * 11,75 ± 0,81 *
≤ 40 лет 2,96 ± 0,43 * 4 , 63 ± 0,36 9,59 ± 1,35
> 40 лет 2,49 ± 0,37 * 5,58 ± 0,26 * 12,73 ± 0, 99 *
Занятость ≤ 10 лет 2,23 ± 0,34 4,90 ± 0,29 10,14 ± 1,16
Занятость> 10 лет 2,84 ± 0,40 5,47 ± 0,28 12,55 ± 1,05
Некурящие 2. 85 ± 0,47 * 5,47 ± 0,30 * 12,81 ± 1,14 *
Курильщики 2,43 ± 0,34 * 5,11 ± 0,31 10,71 ± 1,14 *
Элементы управления
Всего 0,15 ± 0,02 4,33 ± 0,22 7,50 ± 0,98
≤ 40 лет 4,34 ± 0,35 6,83 ± 1,51
> 40 лет 0,14 ± 0,02 4,33 ± 0,28 7,88 ± 1,29
Некурящие 0. 10 ± 0,02 4,23 ± 0,31 8,36 ± 1,60
Курильщики 0,20 ± 0,02 § 4,44 ± 0,32 6,60 ± 1,12

Таблица 4

Доли субъектов с отклонениями в экспериментальной и контрольной группах. Данные относятся к интенсивности хвоста (% ДНК, мигрировавшей в хвосте кометы).

00000 н. 00000 00000 п. 00000
Открытые Элементы управления OR (95% ДИ)
Всего 42 * 16 2. 59 (1,32–5,05)
≤ 40 лет 11 5 2,39 (0,72–7,93)
> 40 лет 31 * 11 .90 2,63 (1,17–5)
Занятость ≤ 10 лет 15
Занятость> 10 лет 27
Некурящие 24 * 2,9330. чем в контроле ( p <0,001). Курение приводило к статистически значимому увеличению уровней 1OHP в контроле ( p <0,001), но не в группе, подвергшейся воздействию. Более того, уровень 1OHP в моче был значительно ниже ( p = 0.046) у электротехников старше 40 лет по отношению к самым молодым испытуемым. Концентрации 1OHP в моче, обнаруженные в настоящем исследовании, коррелируют ( r = 0,732) с воздействием общего количества ПАУ (данные не показаны).

Заводские рабочие показали статистически значимое увеличение среднего повреждения ДНК по сравнению с контрольной группой ( p = 0,002). Привычка к курению не увеличивала степень повреждения ДНК ни в экспериментальной, ни в контрольной группах. Первичные повреждения ДНК были значительно выше ( p = 0.036) у электротехников старше 40 лет по отношению к самым молодым испытуемым.

Групповое среднее значение поврежденных клеток (AST) значительно выше у облученных, чем у контрольных субъектов ( p <0,001). Более того, количество «необычных» субъектов (субъектов, демонстрирующих высокое количество AST) значительно выше в группе воздействия (38,5%), чем в контрольной группе (19,5%), с OR = 2,59 (ДИ 95% 1,32–5,05). . В группе рабочих, подвергшихся воздействию, более высокая частота AST и выбросов в основном приходится на испытуемых в возрасте старше 40 лет с OR = 2.63 (ДИ 95% 1,17–5,90).

Влияние генотипов на биологические конечные точки

Влияние генетических полиморфизмов на концентрацию 1OHP в моче и степень первичного повреждения ДНК показано в таблице. Статистически значимое влияние генетических полиморфизмов наблюдалось только между подвергнутыми воздействию субъектов с EPHX низкой или средней + высокой выведенной активностью для концентрации 1OHP в образцах мочи.

Таблица 5

Концентрация 1-гидроксипирена (1OHP) в моче и степень первичного повреждения ДНК в лейкоцитах периферической крови у рабочих и контрольных субъектов в отношении метаболических генотипов ( CYP1A1 , EPHX и GSTM1 ) . Данные представлены как средние значения группы (± SEM) индивидуума: концентрация 1OHP в моче (выраженная как мкг 1OHP / г креатинина), усредненные значения интенсивности хвоста (% ДНК, мигрировавшей в хвосте кометы, оценивается в 150 клетках) и количество AST .

Средний + Высокий 9039 / м 2 + м 2 / м 2 4,5395 0,19 0,33
1OHP Повреждение ДНК

CYP1A1 ( Msp I) b w 1 / w 1 2. 37 ± 0,29 * 5,08 ± 2,45 * 11,23 ± 0,92 *
w 1 / м 1 + m 1 / м 1 3,33 ± 0,71 * 5,81 13,13 ± 1,65 *
CYP1A1 (Ile / Val) c w 2 / w 2 2,71 ± 0,31 * 5,22 ± 0,22 * * 11,5391
w 2 / m 2 + m 2 / m 2 1.96 ± 0,61 * 5,85 ± 0,75 13,91 ± 2,95
EPHX d Низкий 2,17 ± 0,37 *, § 5,22 ± 0,30 3,19 ± 0,45 * 5,00 ± 0,30 * 10,72 ± 1,16 *
GSTM1 Активный 2,53 ± 0,38 * 5,46 ± 0,29 * 12,14 ± 1,0
Нулевой 2. 79 ± 0,45 * 5,05 ± 0,32 11,22 ± 1,21 *
Элементы управления
CYP1A1 ( Msp4 I 1) 9000 9000 / w 1 0,14 ± 0,02 4,28 ± 0,25 7,24 ± 1,10
w 1 / м 1 + m 1 / m 1 0,239 4,87 ± 0,53 6.54 ± 1,30
CYP1A1 (Ile / Val) c w 2 / w 2 0,14 ± 0,02 4,38 ± 0,24 6,77 ± 0,91
0,20 ± 0,07 4,25 ± 0,30 10,86 ± 5,08
EPHX d Низкое 7,34 ± 1. 13
Средний + высокий 0,16 ± 0,02 4,21 ± 0,30 6,96 ± 1,43
GSTM1 Активный 0,15 ± 0,02 4,49 ± 0,32 4,49 ± 0,32 4,49 ± 0,32
Нулевой 0,15 ± 0,03 4,23 ± 0,31 5,67 ± 1,02

Обсуждение

Это исследование было разработано для оценки профессионального воздействия ПАУ на рабочих, оцениваемых методами биологического мониторинга. на заводе по производству графитовых электродов и у контрольных субъектов с предположительно более низким воздействием ПАУ.Текущее воздействие ПАУ оценивалось путем определения концентрации 1OHP в моче (биомаркера внутренней дозы), тогда как мониторинг биологического эффекта был сосредоточен на оценке степени первичного повреждения ДНК, оцениваемой с помощью анализа комет в PBL (биомаркер биологически эффективной дозы). Кроме того, в этом исследовании мы проанализировали генетические полиморфизмы в генах CYP1A1 ( Msp I и Ile / Val сайты), EPHX (экзоны 3 и 4) и GSTM1 , чтобы оценить влияние этих метаболических генотипов ( биомаркер индивидуальной восприимчивости) от уровня 1OHP в моче и степени первичного повреждения ДНК.

Уровни 1OHP в моче у подвергшихся воздействию рабочих были значительно выше, чем в контрольной группе. Этот вывод согласуется с результатами других исследований, направленных на определение влияния профессионального воздействия ПАУ на концентрацию 1OHP в моче [3,43-45]. Статистически значимое увеличение уровней 1OHP в моче, наблюдаемое у контрольных курильщиков по сравнению с контрольными некурящими, не было подтверждено в группе подвергшихся воздействию рабочих. Этот аспект можно объяснить с точки зрения насыщающей дозы, вероятно, из-за большого эффекта, связанного с работой, при котором дальнейший эффект не может быть замечен при более высоких дозах.

В анализе комет разрыв цепи ДНК количественно оценивается по геометрическим (, например, расстояние миграции) и флуоресценции (, например, процентов флуоресценции мигрировало в хвосте), как на глаз (, то есть, баллов по кометам), так и по компьютерному изображению. анализ. При наличии повреждения ДНК распределение результатов параметров хвоста сильно смещено вправо, и две стороны распределения имеют разный разброс. В этой ситуации на среднее значение сильно влияют экстремальные наблюдения, и, как результат, большое стандартное отклонение, оказывается довольно неинформативным. В этой ситуации асимметричные несимметричные распределения можно было бы более точно определить с помощью медианного значения (, т.е. 50-й процентиль) или значений, соответствующих 75-му / 95-му процентилю [46]. Этот статистический подход в анализе комет был принят в нескольких исследованиях [47-49].

В эпидемиологических исследованиях включенные субъекты должны быть охарактеризованы по данному аспекту простым способом, предпочтительно с помощью одного номера. В этом молекулярном эпидемиологическом подходе мы выбрали для описания степени повреждения ДНК только интенсивность хвоста, параметр, описывающий процент ДНК, мигрировавшего в хвосте, который относительно не зависит от пороговых значений в компьютерной визуализации [42].

Что касается степени первичного повреждения ДНК, анализ комет использовался только в нескольких исследованиях, направленных на оценку генотоксических эффектов ПАУ у подвергшихся воздействию рабочих [45,50-55], с как положительными, так и отрицательными результатами. Однонитевые разрывы ДНК не различались между 99 рабочими на заводе по восстановлению алюминия и 55 неэкспонированными референтами [50]. Профессиональное воздействие ПАУ не привело к увеличению разрывов цепей ДНК у рабочих коксовой печи по сравнению с лицами, не подвергавшимися воздействию [55]. Анализ повреждений ДНК не выявил существенных различий между 42 работниками первичной алюминиевой промышленности и 16 местными жителями, не подвергавшимися профессиональному воздействию ПАУ [51].Эффект профессионального воздействия не наблюдался у 50 рабочих коксовой печи по сравнению с 50 рабочими контрольной группы, не подвергавшимися воздействию ПАУ в степени повреждения ДНК [45]. Воздействие ПАУ вызвало значительно более высокий разрыв однонитевой ДНК в лимфоцитах и ​​гранулоцитах у 24 работников компаний, занимающихся инспекцией автомобильных выбросов, и 28 работников компании по сжиганию мусора, по сравнению с 43 подобранными субъектами, не подвергавшимися воздействию [54]. Степень первичного повреждения ДНК, оцененная с помощью анализа комет, составила 3. У рабочих завода по производству графитовых электродов (n = 29) в 13 раз выше по сравнению с контрольной (n = 32) [52]. Таким образом, результаты настоящей работы согласуются с результатами уникального исследования рабочих завода по производству графитовых электродов [52] и подтверждают доказательства того, что профессиональное воздействие ПАУ во время производства графитовых электродов может привести к первичному повреждению ДНК (цепь разрушение согласно оценке с помощью анализа комет).

Привычка к курению не увеличивала ни один из параметров повреждения ДНК ни в группе воздействия, ни в контрольной группе.Эффект курения как потенциального искажающего фактора в профессиональных исследованиях был недавно оценен в ходе метаанализа имеющихся противоречивых результатов, полученных с помощью метода комет [56]. Авторы пришли к выводу, что эффект курения не может быть формально продемонстрирован, если оценка повреждения ДНК основана на анализе изображений.

Гомозиготные вариантные носители полиморфизма CYP1A1 ( Msp, I и Ile / Val) крайне редко встречаются у кавказцев [57]. Частоты (все предметы), которые мы нашли (2.65 и 0,53% для Msp I и Ile / Val соответственно) согласуются с этими наблюдениями. Частоты аллеля EPHX , обнаруженные в этом исследовании, аналогичны таковым у неиспаноязычных белых [58]. Частота нулевого генотипа GSTM1 (43,4%) среди исследуемой популяции (все субъекты) согласуется с частотами, указанными в литературе для европейской популяции, указывая на то, что 40-50% рассматриваемых субъектов не обладают активностью GSTM1 [59, 60].

Наши результаты показывают, что полиморфизм в экзонах 3 и 4 EPHX связан с более высокими концентрациями 1OHP в моче, тогда как наличие вариантов в гене CYP1A1 (т.е. Msp I и мутации Ile / Val), а также наличие нулевого генотипа GSTM1 , как было показано, не влияли на экскрецию 1OHP с мочой. Повышенная экскреция 1OHP с мочой у субъектов с высокой активностью EPHX согласуется с ранее опубликованными результатами [61]. В то же время отсутствие связи между уровнями 1OHP в моче и присутствием нулевого генотипа GSTM1 не является неожиданным, поскольку 1OHP в основном выводится в виде глюкуронидного конъюгата [62].

Ни один из проанализированных генотипов ( CYP1A1 , EPHX и GSTM1 ) не оказал существенного влияния на первичное повреждение ДНК, как было оценено с помощью анализа комет.Однако сообщалось, что на повреждение ДНК бензо (а) пиреном (, т.е. аддуктов бензо [а] пирендиолепоксида-ДНК) у рабочих коксовых печей, подвергшихся воздействию ПАУ, влияют привычки курения и полиморфизмов GSTM1 [63,64] . Таким образом, в будущем для рабочих, подвергшихся воздействию высоких концентраций ПАУ, может быть интересно сравнить повреждения, вызванные бензо (а) пиреном (такие как аддукты BPDE-ДНК) и разрывом цепи ДНК (по оценке с помощью кометного анализа). также в отношении генетических полиморфизмов.

Не наблюдалось значительной корреляции между уровнями 1OHP в моче и степенью разрыва цепи ДНК (коэффициенты корреляции Спирмена: r = 0.338, r = 0,157 и r = 0,205, для длины хвоста, интенсивности хвоста и момента хвоста соответственно) в этом исследовании. Отсутствие значимых корреляций можно объяснить различной стойкостью рассматриваемых биомаркеров. Фактически, метаболиты в моче (, то есть 1OHP) отражают воздействие во время последней рабочей смены и за несколько дней до него [52], тогда как щелочной анализ комет измеряет временные разрывы цепей, которые происходят до того, как произойдут системы репарации ДНК или обмен клеток [65].

Заключение

Результаты когортного исследования среди рабочих завода по производству графитовых электродов в Италии показали превышение смертности от рака у этих рабочих со стандартизованным коэффициентом смертности 1,27 (ДИ 95% 1,07–1,50) [66]. Основная стратегия первичной профилактики рака — минимизировать воздействие признанных генотоксических / канцерогенных факторов риска. Результаты настоящего исследования вместе с результатами, ранее опубликованными Marczynski et al. [52], показывают, что подходы молекулярной эпидемиологии ( i.е. поперечных исследований биомаркеров генотоксичности) могут сыграть роль в выявлении общих генетических факторов риска, а также попытаться связать эффекты с измеренными данными воздействия. Более того, категоризация субъектов как нормальных или выпадающих, как это было выполнено в этом исследовании, позволила оценить связь между воздействием генотоксинов в этой профессиональной отрасли и повреждением ДНК, подчеркнув повышенный генотоксический риск со статистически значимым OR = 2,59 (ДИ 95% 1,32). –5,05).

Конкурирующие интересы

Автор (ы) заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Вклад авторов

GM, RP 1 участвовали в первоначальном дизайне и концепции исследования.

MDO участвовал и координировал все аспекты исследования, участвовал в разработке исследования, подготовке материалов и протокола исследования, выполнял анализ 1OHP и способствовал интерпретации результатов.

MV и MM участвовали в разработке исследования, подготовке исследовательских материалов и протокола, выполнили анализ комет.

RP 3 , LA участвовала в подготовке материалов исследования и протокола, проводила анализ генотипов.

MM принимал участие в анализе и интерпретации данных, а также разработал и написал первый черновик рукописи. MV, MDO, RP 3 предоставил обширный ввод, отзывы и редактирование по всем разделам статьи.

Все авторы просмотрели и одобрили окончательную версию этой рукописи.

Благодарности

Авторы выражают благодарность профессору Джузеппине Скасселлати-Сфорцолини, почетному профессору гигиены Университета Перуджи, за ее полезную помощь во время исследования и конструктивные комментарии к рукописи.

Ссылки

  • Боффетта П., Йоуренкова Н., Густавссон П. Риск рака в результате воздействия полициклических ароматических углеводородов на рабочем месте и в окружающей среде. Контроль причин рака. 1997. 8: 444–472. DOI: 10,1023 / А: 1018465507029. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Moulin JJ, Wild P, Mur JM, Lafontaine M, Lefer M, Mercier-Gallay M, Villemot P, Whebi V, Coulon JP. Риск рака легких, гортани, глотки и полости рта у рабочих, производящих угольные электроды. Scand J Work Environ Health.1989; 15: 30–37. [PubMed] [Google Scholar]
  • Dell’Omo M, Muzi G, Marchionna G, Latini L, Carrieri P, Paolemili P., Abbritti G. Профилактические меры снижают воздействие полициклических ароматических углеводородов на заводе графитовых электродов. Occup Environ Med. 1998; 55: 401-406. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Monarca S, Pasquini R, Sforzolini GS, Viola V, Fagioli F. Применение анализа мутагенности сальмонелл и определение полициклических ароматических углеводородов на рабочих местах, подверженных воздействию нефтяного пека и нефтяного кокса .Int Arch Occup Environ Health. 1982; 49: 223–239. DOI: 10.1007 / BF00377932. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Паскуини Р., Монарка С., Сфорцолини Г.С., Конти Р., Фаджиоли Ф. Мутагены в моче рабочих с угольными электродами. Int Arch Occup Environ Health. 1982; 50: 387–395. DOI: 10.1007 / BF00377835. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Петри Т., Шмид П., Шлаттер С. Воздействие полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в воздухе и выделение 1-гидроксипирена с мочой работниками угольных анодных установок.Ann Occup Hyg. 1996. 40: 345–357. [PubMed] [Google Scholar]
  • Тета М.Дж., Отт М.Г., Шнаттер АР. Наблюдение за смертностью населения на предприятиях по производству углеродных продуктов. Br JInd Med. 1987. 44: 344–350. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Мори И. Смертность от рака среди рабочих, производящих искусственные графитовые электроды: результаты 38-летнего наблюдения. Occup Environ Med. 2002; 59: 473–480. DOI: 10.1136 / oem.59.7.473. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Густавссон П., Белландер Т., Йоханссон Л., Салмонссон С.Наблюдение за смертностью и заболеваемостью раком среди шведских рабочих с графитовыми электродами. Environ Res. 1995; 70: 7–10. DOI: 10.1006 / enrs.1995.1039. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Донато Ф., Монарка С., Маркионна Дж. , Росси А., Чичони С., Кьеза Р., Колин Д., Боффетта П. Смертность от рака и хронических респираторных заболеваний среди рабочих, производящих угольные электроды. Occup Environ Med. 2000. 57: 484–487. DOI: 10.1136 / oem.57.7.484. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • IARC.Монография МАИР по оценке канцерогенного риска химических веществ для человека. Vol. 32. Лион (Франция): Международное агентство по изучению рака; 1983. Полиядерные ароматические соединения, Часть 1, Химические, экологические и экспериментальные данные. [PubMed] [Google Scholar]
  • Crofts F, Taioli E, Trachman J, Cosma GN, Currie D, Toniolo P, Garte SJ. Функциональное значение различных генотипов CYP1A1 человека. Канцерогенез. 1994; 15: 2961–2963. DOI: 10.1093 / carcin / 15.12.2961. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Коулз Б., Кеттерер Б.Роль глутатиона и трансфераз глутатиона в химическом канцерогенезе. Crit Rev BiochemMol Biol. 1990; 25: 47–70. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ингельман-Сундберг М. Генетическая изменчивость восприимчивости и реакции на токсиканты. Toxicol Lett. 2001; 120: 259–268. DOI: 10.1016 / S0378-4274 (01) 00278-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Паванелло С., Клонферо Э. Биологические индикаторы генотоксического риска и метаболических полиморфизмов. Mutat Res. 2000; 463: 285–308. DOI: 10.1016 / S1383-5742 (00) 00051-X.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Schoket B, Papp G, Levay K, Mrackova G, Kadlubar FF, Vincze I. Влияние метаболических генотипов на уровни биомаркеров генотоксического воздействия. Mutat Res. 2001. 482: 57–69. [PubMed] [Google Scholar]
  • Bartsch H, Nair U, Risch A, Rojas M, Wikman H, Alexandrov K. Генетический полиморфизм генов CYP, отдельно или в комбинации, как модификатор риска рака, связанного с табаком. Биомаркеры эпидемиологии рака Пред. 2000; 9: 3–28. [PubMed] [Google Scholar]
  • Pastorelli R, Guanci M, Cerri A, Negri E, La Vecchia C, Fumagalli F, Mezzetti M, Cappelli R, Panigalli T, Fanelli R и др. Влияние наследственных полиморфизмов глутатион-S-трансферазы M1, микросомальной эпоксидгидролазы, ферментов цитохрома P450 на ДНК и аддукты бензо (а) пирен-диолепоксида в крови. Биомаркеры эпидемиологии рака Пред. 1998. 7: 703–709. [PubMed] [Google Scholar]
  • Рохас М., Александров К., Каскорби И., Брокмоллер Дж., Лихачев А., Пожарисский К., Бувье Дж., Обуртин Дж., Майер Л., Копп-Шнайдер А. и др. Высокие уровни аддукта ДНК бензо [a] пирендиол-эпоксида в легких и клетках крови людей с комбинированными генотипами CYP1A1 MspI / Msp-GSTM1 * 0 / * 0.Фармакогенетика. 1998. 8: 109–118. DOI: 10.1097 / 00008571-199804000-00003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Teixeira JP, Gaspar J, Martinho G, Silva S, Rodrigues S., Mayan O, Martin E, Farmer PB, Rueff J. Уровни аддуктов ароматической ДНК у работников коксовых печей: корреляция с полиморфизмы в генах GSTP1, GSTM1, GSTT1 и CYP1A1. Mutat Res. 2002; 517: 147–155. [PubMed] [Google Scholar]
  • Au WW, Oh HY, Grady J, Salama SA, Heo MY. Использование генетической предрасположенности и биомаркеров для оценки риска для здоровья, связанного с окружающей средой.Environ Mol Mutagen. 2001; 37: 215–225. DOI: 10.1002 / em.1030. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Аутруп Х. Генетические полиморфизмы в ферментах, метаболизирующих xenobiotica человека, как факторы чувствительности при токсической реакции. Mutat Res. 2000. 464: 65–76. [PubMed] [Google Scholar]
  • Raaka S, Hassett C, Omiencinski CJ. Эпоксидгидролаза микросом человека: генетический полиморфизм 5′-фланкирующей области. Канцерогенез. 1998. 19: 387–393. DOI: 10,1093 / carcin / 19.3.387. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Board P, Coggan M, Johnston P, Ross V, Suzuki T, Webb G.Генетическая гетерогенность трансфераз глутатиона человека: комплекс семейств генов. Pharmacol Ther. 1990; 48: 357–369. DOI: 10.1016 / 0163-7258 (90) -6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Бинкова Б., Топинка Дж., Мрачкова Г., Гайдосова Д., Видова П., Ставкова З., Петерка В., Пильчик Т., Римар В., Добиас Л. и др. Работники коксовых печей изучают: влияние воздействия генотипов GSTM1 и NAT2 на уровни аддуктов ДНК в лейкоцитах и ​​лимфоцитах, определяемые с помощью 32P-постмаркировки. Mutat Res.1998. 416: 67–84. [PubMed] [Google Scholar]
  • Alexandrie AK, Warholm M, Carstensen U, Axmon A, Hagmar L, Levin JO, Ostman C, Rannug A. Полиморфизмы CYP1A1 и GSTM1 влияют на уровень 1-гидроксипирена в моче после воздействия ПАУ. Канцерогенез. 2000. 21: 669–676. DOI: 10,1093 / carcin / 21.4.669. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Срам Р.Дж., Бинкова Б. Исследования молекулярной эпидемиологии воздействия мутагенов и канцерогенов на рабочем месте и в окружающей среде, 1997–1999. Перспектива здоровья окружающей среды.2000; 108: 57–70. DOI: 10.2307 / 3454632. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Jongeneelen FJ, Anzion RB, Henderson PT. Определение гидроксилированных метаболитов полициклических ароматических углеводородов в моче. J Chromatogr. 1987; 413: 227–232. DOI: 10.1016 / 0378-4347 (87) 80230-X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • VanRooij JG, Bodelier-Bade MM, Jongeneelen FJ. Оценка индивидуального кожного и респираторного поглощения полициклических ароматических углеводородов у 12 рабочих коксовой печи.Br J Ind Med. 1993; 50: 623–632. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Тайс Р.Р., Агурелл Э., Андерсон Д., Берлинсон Б., Хартманн А., Кобаяши Х., Миямае Й., Рохас Э., Рю Дж. К., Сасаки Ю.Ф. Анализ одноклеточного геля / кометы: руководство по генетическому токсикологическому тестированию in vitro и in vivo. Environ Mol Mutagen. 2000; 35: 206–221. DOI: 10.1002 / (SICI) 1098-2280 (2000) 35: 3 <206 :: AID-EM8> 3.0.CO; 2-J. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Pastorelli R, Cerri A, Rozio M, Dell’Omo M, Muzi G, Abbritti G, Fanelli R, Airoldi L.Аддукты бензо (а) пирендиолепоксида к альбумину у рабочих, подвергшихся воздействию полициклических ароматических углеводородов: ассоциация со специфическими генотипами CYP1A1, GSTM1, GSTP1 и EHPX. Биомаркеры. 2001. 6: 357–374. DOI: 10.1080 / 13547500110044267. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Hayashi S, Watanabe J, Kawajiri K. Генетические полиморфизмы в 5′-фланкирующей области изменяют регуляцию транскрипции гена цитохрома P450IIE1 человека. J. Biochem (Токио), 1991; 110: 559–565. [PubMed] [Google Scholar]
  • Cascorbi I, Brockmoller J, Roots I.Полиморфизм C4887A в экзоне 7 человеческого CYP1A1: популяционная частота, мутации и влияние на предрасположенность к раку легких. Cancer Res. 1996; 56: 4965–4969. [PubMed] [Google Scholar]
  • Белл Д.А., Тейлор Дж. А., Полсон Д. Ф., Робертсон К. Н., Молер Дж. Л., Люсьер Г. В.. Генетический риск и воздействие канцерогенов: распространенный наследственный дефект гена метаболизма канцерогенов глутатион-S-трансферазы M1 (GSTM1), повышающий предрасположенность к раку мочевого пузыря. J Natl Cancer Inst. 1993; 85: 1159–1164. DOI: 10.1093 / jnci / 85.14.1159. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Brendler-Schwaab SY, Schmezer P, Liegibel U, Weber S, Michalek K, Tompa A, Pool-Zobel BL. Клетки различных тканей для исследований in vitro и in vivo в токсикологии: Сборник методов выделения. Токсикология in vitro. 1994; 8: 1285–1302. DOI: 10.1016 / 0887-2333 (94)

    -8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

  • Jones KH, Senft JA. Усовершенствованный метод определения жизнеспособности клеток путем одновременного окрашивания флуоресцеина диацетат-пропидий йодид.J Histochem Cytochem. 1985; 33: 77–79. [PubMed] [Google Scholar]
  • Сингх Н.П., Маккой М.Т., Тайс Р.Р., Шнайдер Э.Л. Простой метод количественного определения низких уровней повреждений ДНК в отдельных клетках. Exp Cell Res. 1988; 175: 184–191. DOI: 10.1016 / 0014-4827 (88) -0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Вильярини М., Моретти М., Паскини Р., Скасселлати-Сфорцолини Дж., Фатигони С., Маркарелли М., Монарка С., Родригес А.В. Генотоксические эффекты инсектицида дельтаметрина in vitro на лейкоциты периферической крови человека: повреждение ДНК («кометный» анализ) в связи с индукцией обменов сестринских хроматид и микроядер.Токсикология. 1998. 130: 129–139. DOI: 10.1016 / S0300-483X (98) 00097-3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Villarini M, Scassellati-Sforzolini G, Moretti M, Pasquini R. Генотоксичность тербутрина in vitro оценивалась с помощью щелочного одноклеточного микрогелевого электрофореза «кометный». Cell Biol Toxicol. 2000. 16: 285–292. DOI: 10,1023 / А: 1026794213308. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Moretti M, Villarini M, Scassellati-Sforzolini G, Monarca S, Salucci A, Vicent Rodriguez A. Применение одноэлементного гель-электрофореза («комета») к анализу выявление первичных повреждений ДНК у рабочих резиновой промышленности: сравнение ручного и компьютерного анализа.Токсикологическая и экологическая химия. 1999. С. 13–24.
  • Bonassi S, Fontana V, Ceppi M, Barale R, Biggeri A. Анализ коррелированных данных в исследованиях биомониторинга человека. Случай клеток с высокой частотой обмена сестринских хроматид. Mutat Res. 1999; 438: 13–21. [PubMed] [Google Scholar]
  • Коллинз АР. Кометный анализ повреждений и репарации ДНК: принципы, применения и ограничения. Mol Biotechnol. 2004. 26: 249–261. DOI: 10.1385 / MB: 26: 3: 249. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Нан Х.М., Ким Х., Лим Х.С., Чой Дж. К., Кавамото Т., Кан Дж. У., Ли СН, Ким Ю. Д., Квон Э.Влияние занятий, образа жизни и генетического полиморфизма CYP1A1, CYP2E1, GSTM1 и GSTT1 на концентрацию 1-гидроксипирена и 2-нафтола в моче. Канцерогенез. 2001; 22: 787–793. DOI: 10,1093 / carcin / 22.5.787. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Ovrebo S, Haugen A, Fjeldstad PE, Hemminki K, Szyfter K. Биологический мониторинг воздействия полициклических ароматических углеводородов на заводе по производству электродной пасты. J Occup Med. 1994; 36: 303–310. DOI: 10.1097 / 00043764-199403000-00007. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Siwinska E, Mielzynska D, Kapka L.Связь между 1-гидроксипиреном в моче и генотоксическими эффектами у рабочих коксовой печи. Occup Environ Med. 2004; 61: e10. DOI: 10.1136 / oem.2002.006643. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Duez P, Dehon G, Kumps A, Dubois J. Статистика анализа комет: ключ к различению генотоксических эффектов. Мутагенез. 2003. 18: 159–166. DOI: 10.1093 / mutage / 18.2.159. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Buschini A, De Palma G, Poli P, Martino A, Rossi C, Mozzoni P, Scotti E, Buzio L, Bergamaschi E, Mutti A.Генетический полиморфизм ферментов, метаболизирующих лекарства, и индуцированное стиролом повреждение ДНК. Environ Mol Mutagen. 2003. 41: 243–252. DOI: 10.1002 / em.10150. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Лу И, Моримото К., Накаяма К. Практика здоровья и повреждение ДНК лейкоцитов у японских рабочих, занимающихся твердыми металлами. Предыдущая Мед. 2006. 43: 140–144. DOI: 10.1016 / j.ypmed.2006.03.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Sigurdson AJ, Hauptmann M, Alexander BH, Doody MM, Thomas CB, Struewing JP, Jones IM. Повреждение ДНК при раке щитовидной железы и множественных случаях рака, контрольной группе и долгоживущих лицах.Mutat Res. 2005; 586: 173–188. [PubMed] [Google Scholar]
  • Carstensen U, Hou SM, Alexandrie AK, Hogstedt B, Tagesson C, Warholm M, Rannug A, Lambert B, Axmon A, Hagmar L. Влияние генетических полиморфизмов ферментов биотрансформации на генные мутации, разрывы цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты и микроядер в мононуклеарных клетках крови и 8-гидроксидезоксигуанозин в моче у рабочих, подвергшихся воздействию полиароматических углеводородов. Scand J Work Environ Health. 1999; 25: 351–360. [PubMed] [Google Scholar]
  • Crebelli R, Carta P, Andreoli C, Aru G, Dobrowolny G, Rossi S, Zijno A.Биомониторинг работников первичной алюминиевой промышленности: обнаружение микроядер и восстанавливаемых повреждений ДНК с помощью щелочного SCGE. Mutat Res. 2002; 516: 63–70. [PubMed] [Google Scholar]
  • Marczynski B, Rihs HP, Rossbach B., Holzer J, Angerer J, Scherenberg M, Hoffmann G, Bruning T, Wilhelm M. Анализ 8-оксо-7,8-дигидро-2 ‘ -дезоксигуанозин и разрывы цепей ДНК в белых кровяных тельцах рабочих, подвергшихся профессиональному облучению: сравнение с данными мониторинга окружающей среды, метаболитов в моче и полиморфизма ферментов.Канцерогенез. 2002; 23: 273–281. DOI: 10,1093 / carcin / 23.2.273. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Moretti M, Villarini M, Scassellati-Sforzolini G, Monarca S, Libraro M, Fatigoni C, Donato F, Leonardis C, Perego L. Биологический мониторинг генотоксической опасности у рабочих резиновая промышленность. Перспектива здоровья окружающей среды. 1996. 104: 543–545. DOI: 10,2307 / 3432820. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Sul D, Oh E, Im H, Yang M, Kim CW, Lee E. Повреждение ДНК в T- и B-лимфоцитах и ​​гранулоцитах при проверке выбросов и рабочие-мусоросжигатели, подвергшиеся воздействию полициклических ароматических углеводородов.Mutat Res. 2003. 538: 109–119. [PubMed] [Google Scholar]
  • ван Делфт Дж. Х., Стинвинкель М. С., ван Астен Дж. Г., де Фогель Н., Брюнтьес-Розье Т. К., Скоутен Т., Крамерс П., Маас Л., ван Хервейнен М. Х., ван Шутен Ф. и др. Биологический мониторинг воздействия полициклических ароматических углеводородов на работников коксовой печи в связи с курением и генетическим полиморфизмом для GSTM1 и GSTT1. Ann Occup Hyg. 2001; 45: 395–408. [PubMed] [Google Scholar]
  • Hoffmann H, Hogel J, Speit G. Влияние курения на эффекты ДНК в тесте на кометы: метаанализ.Мутагенез. 2005. 20: 455–466. DOI: 10.1093 / mutage / gei064. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Cosma G, Crofts F, Currie D, Wirgin I, Toniolo P, Garte SJ. Расовые различия в полиморфизмах длины рестрикционных фрагментов и индуцируемости информационной РНК гена CYP1A1 человека. Биомаркеры эпидемиологии рака Пред. 1993; 2: 53–57. [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhao H, Spitz MR, Gwyn KM, Wu X. Полиморфизм микросомальной эпоксидгидролазы и риск рака легких у неиспаноязычных белых. Mol Carcinog.2002; 33: 99–104. DOI: 10.1002 / mc.10023. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Хирвонен А., Хусгафвел-Пурсиайнен К., Анттила С., Вайнио Х. Нулевой генотип GSTM1 как потенциальный модификатор риска плоскоклеточного рака легкого. Канцерогенез. 1993; 14: 1479–1481. DOI: 10.1093 / carcin / 14.7.1479. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Somorovska M, Jahnova E, Tulinska J, Zamecnikova M, Sarmanova J, Terenova A, Vodickova L, Liskova A, Vallova B, Soucek P, et al. Биомониторинг профессионального воздействия стирола на заводе по ламинированию пластмасс.Mutat Res. 1999; 428: 255–269. [PubMed] [Google Scholar]
  • Кульюкка-Рабб Т., Нюлунд Л., Вааранринта Р., Савела К., Мутанен П., Вейдебаум Т., Сорса М., Раннуг А., Пелтонен К. Влияние соответствующих генотипов на биомаркеры, связанные с воздействием ПАУ. J Expo Anal Environ Epidemiol. 2002; 12: 81–91. DOI: 10.1038 / sj.jea.7500204. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Апостоли П., Нери Дж., Лукас Д., Манно М., Берту Ф. Влияние генетических полиморфизмов CYP1A1 и GSTM1 на уровни 1-гидроксипирена в моче.Toxicol Lett. 2003. 144: 27–34. DOI: 10.1016 / S0378-4274 (03) 00227-3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Pavanello S, Pulliero A, Siwinska E, Mielzynska D, Clonfero E. Снижение эксцизионной репарации нуклеотидов и генотипы с нулевым GSTM1 влияют на уровни аддуктов анти-B [a] PDE-ДНК в мононуклеарных лейкоциты у рабочих коксовой печи, подвергшихся высокому воздействию ПАУ. Канцерогенез. 2005. 26: 169–175. DOI: 10,1093 / carcin / bgh403. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Рохас М., Каскорби И., Александров К., Крик Э., Обуртин Г., Майер Л., Копп-Шнайдер А., Рутс И., Бартч Х.Модуляция уровней аддукта бензо [a] пирендиолепоксид-ДНК в лейкоцитах человека с помощью полиморфизма CYP1A1, GSTM1 и GSTT1. Канцерогенез. 2000; 21: 35–41. DOI: 10,1093 / carcin / 21.1.35. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Cotelle S, Ferard JF. Анализ комет в генетической экотоксикологии: обзор. Environ Mol Mutagen. 1999; 34: 246–255. DOI: 10.1002 / (SICI) 1098-2280 (1999) 34: 4 <246 :: AID-EM4> 3.0.CO; 2-V. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Мерло Д.Ф., Гараттини С., Гелатти Ю., Симонати К., Коволо Л., Чеппи М., Донато Ф.Когортное исследование смертности среди рабочих завода по производству графитовых электродов в Италии. Occup Environ Med. 2004; 61: e9. DOI: 10.1136 / oem.2003.009357. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

(PDF) Полиморфизм в гене микросомальной эпоксидгидролазы связан с преэклампсией

(n = 96) или без нее (n = 87) дром HELLP syn-

, который был описан ранее.

13

Наблюдательный совет учреждения одобрил экспериментальный протокол

.Преэклампсия была определена как возникновение после 20 недель беременности

диастолического артериального давления выше 90

мм рт.

протеинурия (белок в моче более 0,3 г / л

за 24-часовой период сбора мочи). Синдром

HELLP был определен как одновременное появление количества тромбоцитов менее

100 × 10

9

/ л, сывороточной аспартатаминотрансферазы

и концентрации аланинаминотрансферазы

в сыворотке выше

30 МЕ / л и гемолиз

, установленный на основании патологического мазка крови.Группа

из 151 случайно выбранной небеременной женщины,

белых голландских женщин без основного диабета

или почечного, печеночного, гематологического,

ранее существовавшего гипертонического или сердечно-сосудистого заболевания

легкости, у которых были нормальные нормотен-

только беременных (среднее число беременных

нанок 2, диапазон от 1 до 4) служили в качестве контроля.

Общая популяционная характеристика контрольных групп

и случаев в период, когда они были госпитализированы с преэклампсией

, приведены в таблице 1.

АНАЛИЗ МУТАЦИЙ

После получения информированного согласия был проведен забор крови

. Кровь собирали путем венепункции

в стерильные, силиконизированные, этилен-

диаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) 4 мл вакуумные пробирки

(Becton Dickinson, Meylan cedex,

Франция). Сразу после сбора кровь

хранилась при -20 ° C до анализа. Геномную ДНК

выделяли из цельной крови с использованием набора для очистки геномной ДНК

Wizard

TM

, ac-

в соответствии с инструкциями производителя

(Promega, Мэдисон, Висконсин, США).

Были исследованы два отдельных полиморфизма в EPHX,

, а именно 113Tyr → His в экзоне 3 и

139His → 39Arg в экзоне 4.

Сначала образцы ДНК амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

с использованием модификации

метода, описанного Has-

set et al.

12

Реакционная смесь для ПЦР содержала

примерно 100 нг геномной ДНК, 50

ммоль / л KCl, 10 ммоль / л Трис-HCl, pH 8,0, 2.0

ммоль / л MgCl

2

, 1,5UofTa q полимеразы и 1

мкмоль / л каждый из конкретных праймеров прямой (смысловой) и

обратной (антисмысловой) амплификации в общем объеме

50 мкл. ДНК денатурировали при

94 ° C в течение пяти минут. Тридцать циклов амплификации катиона

начинались с денатурации при 93 ° C, отжига праймера

при 58 ° C для экзона 3 и 65 ° C для

экзона 4 и удлинения при 72 ° C, каждый шаг для

экзона. минута.Для обнаружения варианта 113Tyr → His

продукт ПЦР расщепляли

Tth211 и затем подвергали электрофорезу

в 3% агарозном геле. Аллель 113Tyr был

, идентифицированный непереваренной одиночной полосой ДНК

из 231 пары оснований (п.н.), тогда как кодирующий аллель 113His

давал две полосы ДНК по 209 п.н.,

,

и 22 п.н. Для обнаружения варианта 139His → Arg,

продукт ПЦР расщепляли RsaI и

, затем прогоняли в 3% агарозном геле.Кодирующий аллель 139His

был идентифицирован двумя полосами ДНК

(295 и 62 п.н.), тогда как аллель 139Arg

давал три полосы ДНК после расщепления

(174, 121 и 62 п.н.). Компания Pharmacia Biotech

(Roosendaal, Нидерланды) синтезировала все праймеры

, и все химические вещества, необходимые для ПЦР

, были приобретены у Promega (Мэдисон, Висконсин,

США).

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Клинические характеристики между группами составляли

по сравнению с использованием U-критерия Манна-Уитни.

Статистическая значимость различий для

индивидуальных полиморфизмов между различными

группами и прогнозируемая активность фермента

(высокая, средняя или низкая активность) была протестирована

с помощью анализа хи-квадрат (÷

2

). с поправкой Йейтса

в таблицах непредвиденных обстоятельств 2 × 3. Статистическая значимость

была принята за p <0,05. Все статистические анализы

были выполнены с помощью пакета статистических программ SPSS

(SPSS Inc, Chi-

cago, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Средний возраст между случаями и контрольной группой

существенно не отличался. Не было

значительных различий в сроке беременности, рождении,

материнском возрасте или диастолическом артериальном давлении

между группами преэклампсии с синдромом HELLP или

без него.

Распределение полиморфных вариантов в

как экзоне 3, так и экзоне 4 гена EPHX у

пациентов

и контрольной группы суммировано в таблице 2.

В контрольной группе 113His, кодирующий аллель

в экзоне 3, соответствующий низкой активности фермента

, встречался чаще, чем кодирующий аллель 113Tyr

. Шестьдесят семь (44%) из контрольных

были гомозиготными по полиморфизму экзона 3

(His113 His113) и 60 (40%) были

гетерозиготными (Tyr113 His113). Мы обнаружили статистически значимо более высокую частоту

быстрого генотипа

Tyr113 Tyr113 в экзоне 3 среди

женщин с преэклампсией в анамнезе (29%)

по сравнению с контрольной группой (16%, отношение шансов (OR)

).

2.0, 95% доверительный интервал (ДИ) 1,2-3,7)

2

= 9,99, p = 0,0068) при сравнении генотипа Tyr113

Tyr113 с генотипом Tyr113 His113

и His113 His113. Подгруппа

Таблица 1 Характеристики случаев и контроля в период, когда они были госпитализированы по поводу

преэклампсии

Преэклампсия без

HELLP (n = 87)

Преэклампсия с

HELLP (n = 96)

Небеременная

контрольная (n = 151)

Возраст (лет) 28 (19–40) 28 (19–39) 30 (18–42)

Гестационный возраст (нед

дня

)

) 31

+5

(26

+3

–38

+2

) 31

+1

(23

+6

–37

+6

+6

+) —

Нерожавшие 67 (79%) 83 (86%) —

Диастолическое АД (мм рт. Ст.) 110 (90–160) 110 (90–145) ND

Значения даны в виде медианы (диапазон) или чисел (процент ) в зависимости от ситуации.

АД, артериальное давление; НД, не определено.

Таблица 2 Распределение полиморфных вариантов в экзонах 3 и 4 гена EPHX

Вариант гена

Преэклампсия

без HELLP

(n = 87)

Преэклампсия

с HELLP

(n =

= 96)

Преэклампсия, все

(n = 183)

Контрольные

(n = 151)

Экзон 3 Tyr113 Tyr113 27 (31) 24 (25) 51 (28) * 24 (16) *

Tyr113 His113 22 (25) 26 (27) 48 (26) 60 (40)

His113 His113 38 (44) 46 (48) 84 (46) 67 (44)

Экзон 4 His139 His139 54 (62 ) 49 (51) 103 (56) 96 (64)

His139 Arg139 27 (31) 40 (42) 67 (37) 50 (33)

Arg139 Arg139 6 (7) 7 (7) 13 (7) 5 (3)

Оценка генетических полиморфизмов описана в Методах.Проценты указаны в паспорте

тезисов. Статистическая значимость различий между пациентом и контрольной группой оценивалась с помощью критерия хи-квадрат

.

EPHX, эпоксидгидролаза; Тир, тирозин; Его, гистидин; Арг, аргинин.

* p <0,01 преэклампсия по сравнению с контролем.

Микросомальная эпоксидгидролаза и преэклампсия 235

www.jmedgenet.com

Фармацевтические препараты | Бесплатный полнотекстовый | Роль полиморфизма CYP2C9, CYP2C19 и EPHX в фармакокинетике фенитоина: исследование уругвайских субъектов европеоидной расы

1.Введение

Фенитоин (PHT) — широко назначаемый противоэпилептический препарат, одобренный для использования для лечения нескольких типов судорог. Сообщалось, что биотрансформация PHT происходит через несколько параллельных метаболических путей, основным из которых является пара-гидроксилирование с образованием неактивного метаболита п-гидроксифенитоина (p-HPPH). Его образование происходит через нестабильный промежуточный арен-оксид, и ферменты, участвующие в этой метаболической стадии, — это CYP2C9 и CYP2C19, первый из которых отвечает за 90% пара-гидроксилирования.Большая часть образующегося p-HPPH затем конъюгируется с глюкуронидом с помощью изофермента уридин-5-дифосфоглюкуронозилтрансферазы 1A (UGT1A) с образованием гидроксифенитоин-O-глюкуронида, который затем выводится с мочой. p-HPPH также может подвергаться дальнейшему окислению CYP2C19, 2C9 и 3A4, что приводит к образованию катехолов. Несмотря на то, что на p-HPPH приходится 60–88% введенного PHT, промежуточное соединение на основе оксида арена также может быть преобразовано в дигидродиол PHT через микросомальную эпоксидгидролазу (EPHX), что составляет дополнительные 7–11%.Дигидродиол можно превратить в катехол или конъюгировать с глюкуронидом. Менее 5% введенной дозы PHT выводится в неизмененном виде с мочой [1,2,3,4]. Также были описаны другие второстепенные метаболиты, такие как фенитоин-N-глюкуронид, 4,4′-дигидроксифенитоин (производное п-гидроксилированного на обоих фенильных кольцах), метаболит, образующийся в результате расщепления гидантоинового кольца, и мета-гидроксифенитоин. Однако этот м-изомер, по-видимому, является аналитическим артефактом, образующимся во время кислотного гидролиза мочи, который проводится для отделения первичных метаболитов от конъюгатов глюкуронида, а не естественного метаболита PHT [2,4,5].Большинство ферментов, участвующих в метаболизме PHT, таких как CYP2C9, CYP2C19 и EPHX, экспрессируются полиморфно. Что касается ферментов CYP, по крайней мере, 60 и 35 вариантных аллелей были идентифицированы для CYP2C9 и CYP2C19 соответственно [6]. Наиболее распространенными аллельными вариантами обоих ферментов являются обозначенные * 2 и * 3, которые являются следствием однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) для CYP2C9 и одноточечной мутации для CYP2C19, оба на хромосоме 10 [3,7,8,9]. CYP2C9 * 2 вызывается переходом C> T в паре оснований 430 (rs 1799853) в экзоне 3, что приводит к замене аргинина на цистеин в аминокислотном остатке 144 (Arg144Cys).Трансверсия A> C в паре оснований 1075 в экзоне 7 (rs 1057910), которая приводит к замене изолейцина на лейцин в кодоне 359 (Ile359Leu), определяет аллельный вариант CYP2C9 * 3 [3,8,9,10,11 , 12]. С другой стороны, полиморфные изоформы CYP2C19 * 2 и CYP2C19 * 3 вызваны переходом G> A в парах оснований 681 в экзоне 5 (rs 4244285) и 683 в экзоне 4 (rs 4986893), соответственно. 681G> Мутация определяет аберрантный сплайсинг, приводящий к измененной рамке считывания мРНК и преждевременному прекращению синтеза белка, что приводит к нефункциональному ферменту.Мутация 683 G> A определяет преждевременный стоп-кодон, который приводит к усеченному белку [2,9,10,12,13]. Снижение каталитической активности CYP2C9 * 2, наблюдаемое по сравнению с диким типом, является следствием снижения максимальной скорости выведения (Vmax). Однако для аллельного варианта * 3 каталитическая активность значительно снижается не только из-за уменьшения Vmax, но также из-за снижения сродства к субстрату, что означает увеличение Km [7,8,9,14,15] Комбинация аллелей * 2 и * 3 дает шесть различных генотипов для каждого фермента, и в соответствии с этим индивидуумов можно разделить на нормальных метаболизаторов (NM), промежуточных метаболизаторов (IM) или слабых метаболизаторов (PM).Лица, гомозиготные по аллелю дикого типа (* 1 / * 1), обладают нормальной ферментативной активностью и классифицируются как NM. Однако у людей, несущих хотя бы один мутировавший аллель, активность фермента снижается. Гетерозиготные, несущие один аллель дикого типа и один мутантный аллель (* 1 / * 2 или * 1 / * 3), имеют слабое или умеренное снижение активности фермента и классифицируются как IM, тогда как индивидуумы, которые являются гомозиготными, несущими два мутантных аллеля (* 2 / * 2, * 2 / * 3 или * 3 / * 3), имеют значительное снижение активности фермента и классифицируются как PM [1,16].Ген, кодирующий EPHX, был локализован в хромосоме 1p11-qter, и было описано несколько мутаций. Однако считалось, что только два из них представляют генетический полиморфизм у кавказцев [9,17,18]. Переход T> C в экзоне 3, который приводит к замене тирозина на гистидин в остатке 113 (Tyr113His), вызывает снижение активности фермента примерно на 50%. С другой стороны, переход A> G в экзоне 4, который вызывает замену гистидина на аргинин в кодоне 139 (His139Arg), был связан с увеличением активности фермента на 25% [9,17,19].С учетом комбинаций аллелей описаны три фенотипа. Субъекты, которые представляют аллель дикого типа гомозиготно, а также те, которые являются гетерозиготными по обоим аллельным вариантам, обладают промежуточной ферментативной активностью. Однако снижение активности фермента проявляется при гомозиготности His113 или гетерозиготности His113 (мутированный аллель в экзоне 3) в сочетании с гомозиготностью His139 (аллель дикого типа в экзоне 4), а увеличение активности фермента происходит при гомозиготности Arg139 или гетерозиготности Arg139 (мутировавшая аллель в экзоне 4) в сочетании с гомозиготностью Tyr113 (аллель дикого типа в экзоне 3) [20].PHT характеризуется нелинейной фармакокинетикой, узким терапевтическим диапазоном и острыми дозозависимыми побочными эффектами, которые варьируются от разрастания десен до кожных высыпаний. Это может объяснить, почему терапевтический мониторинг лекарственных препаратов стал полезным инструментом для врачей. Тем не менее, полиморфизмы CYP2C9, CYP2C19 и EPHX, которые ответственны за изменения активности ферментов, редко принимаются во внимание, и они могут иметь клиническое значение при лечении этим препаратом. Фактически, в фармакокинетическом исследовании на здоровых добровольцах, сравнивающем два разных режима дозирования PHT, у некоторых субъектов были обнаружены кожные реакции [21].Авторы сообщили, что увеличение выработки или снижение детоксикации ареноксида во время метаболизма PHT, по-видимому, было причиной наблюдаемой нежелательной реакции на лекарственные средства (ADR). Изучение полиморфизма EPHX у этих субъектов показало, что все люди с кожной сыпью имели мутации в EPHX. Таким образом, как было заявлено авторами, хотя несколько факторов могут увеличивать концентрацию реактивного ареноксида, одним из них является снижение активности EPHX.Фармакогенетические исследования показали, что генетические дефекты ферментов, метаболизирующих лекарства, кодируемых CYP2C9, CYP2C19, могут иметь важное влияние на фармакокинетику ПТГ. Снижение каталитической активности CYP2C9 и CYP2C19 может увеличить концентрацию PHT и спровоцировать другие типы нежелательных реакций, более связанных с центральной нервной системой. Тем не менее в литературе мало информации о роли полиморфизма EPHX в фармакокинетике PHT [22,23,24,25].

Целью этого исследования было оценить влияние полиморфизмов CYP2C9, CYP2C19 и EPHX на метаболизм PHT путем измерения концентраций PHT и p-HPPH в плазме у уругвайских пациентов с эпилепсией.

2. Результаты

Генотипы CYP2C9 и CYP2C19 и частоты фенотипов показаны в Таблице 1 и Таблице 2, соответственно. У 26 пациентов (52,0%) не было мутаций ни в CYP2C9, ни в CYP2C19 (* 1 / * 1 для обоих ферментов), и только у двух (4,0%) пациентов были генетические мутации в обоих ферментах. Одиннадцать (22,0%) и четыре (8,0%) пациентов были гетерозиготными по Arg144Cys (CYP2C9 * 1 / * 2) и Ile359Leu (CYP2C9 * 1 / * 3) соответственно. Поэтому они были классифицированы как IM для CYP2C9. Один (2,0%) пациент был гомозиготным по * 2 варианту CYP2C9 и классифицировался как PM.Остальные тридцать четыре пациента (68,0%) были классифицированы как NM для этого фермента, поскольку они имели генотип * 1 / * 1. Таким образом, частоты аллелей CYP2C9 * 2 и CYP2C9 * 3 составляют 0,13 и 0,04 соответственно. С другой стороны, сорок пациентов (80,0%) были классифицированы как NM по CYP2C19, поскольку они были гомозиготными по аллелю дикого типа (* 1 / * 1). Остальные десять (20,0%) пациентов были классифицированы как IM в связи с тем, что они были гетерозиготными по варианту * 2 (CYP2C19 * 1 / * 2). Ни один пациент не был классифицирован как ПМ ​​по этому ферменту, поскольку никто не был гомозиготным по аллелю * 2.Ни у одного пациента не было обнаружено мутации CYP2C19 * 3. Следовательно, частота аллеля для CYP2C19 * 2 составляет 0,10. Частоты генотипов и фенотипов EPHX показаны в Таблице 3, Таблице 4 и Таблице 5. Что касается полиморфизма в экзоне 3 (Tyr113His), двадцать один (42,0%) пациент был гомозиготен по Tyr113 ( аллель дикого типа), остальные двадцать два (44,0%) были гетерозиготными, а остальные семь (14,0%) были гомозиготными по His113. Учитывая полиморфизм экзона 4 (His139Arg), тридцать семь (74,0%) пациентов были гомозиготными по His139 (аллель дикого типа), одиннадцать (22.0%) были гетерозиготными, а остальные два (4,0%) были гомозиготными по Arg139. Принимая во внимание эти результаты, двадцать два (44,0%) пациента были сочтены промежуточными, пять (10,0%) пациентов — повышенной и двадцать три (46,0%) — пониженной активности фермента EPHX.

Дозы были нормализованы по весу пациентов, и общая средняя доза составила 4,388 мг / кг (диапазон 1,852–8,889). Концентрации PHT и p-HPPH были получены у всех 50 пациентов по крайней мере в трех случаях, и средние концентрации были рассчитаны для каждого пациента.Концентрации PHT и p-HPPH корректировались нормализованной дозой (с этого момента [PHT] и [p-HPPH], соответственно), чтобы проверить влияние генотипа на концентрацию лекарственного средства при той же суточной дозе. По этой причине единицы концентрации, нормализованные по дозе, равны кг / л (мг · л -1 / мг · кг -1 ). Средние значения концентрации составляли 1,789 кг / л (диапазон 0,5279–4,055) и 0,0240 кг / л (диапазон 0,0076–0,0708) для PHT и p-HPPH соответственно.

Средние значения нормализованной дозы PHT, [PHT] и [p-HPPH] в каждой парной группе фенотипа CYP2C9 / CYP2C19 показаны в таблице 6.Различия в [PHT] и [p-HPPH] среди групп NM / NM, NM / IM и IM / NM не были значительными (ANOVA, p> 0,2). Сравнение отдельных значений [PHT] и [p-HPPH], полученных из группы IM / IM (среднее из двух данных) или группы PM / NM (отдельные данные), с каждой из предыдущих групп оценивалось с помощью простого t-критерия Стьюдента. , оценивая, могут ли эти значения принадлежать каждой соответствующей совокупности. Что касается IM / IM, [PHT] значительно отличался от всех трех популяций (pppp Средние значения нормализованной дозы PHT, [PHT] и [p-HPPH] для фенотипов CYP2C9, CYP2C19 и EPHX показаны в таблице 7.Различия в [PHT] и [p-HPPH] изучались при фиксированной одной переменной. Это означает, что фенотип хотя бы одного из ферментов был одинаковым среди исследуемых групп.

Чтобы изучить влияние EPHX на метаболизм PHT-ареноксида, следует анализировать только [p-HPPH], потому что различия в активности EPHX могут изменять только концентрацию продуктов, поступающих из молекулы-предшественника. Для обоих нормальных метаболизаторов CYP не было обнаружено значительных различий между различными группами в соответствии с активностью EPHX (ANOVA, p = 0.5). Несмотря на то, что средние значения [PHT] существенно не различались, их значения распределяются по широкому диапазону в следующем порядке: пониженное или промежуточное> повышенное относительно фенотипа EPHX.

Для изучения влияния обоих CYP на метаболизм PHT и p-HPPH сравнивали группы с различиями в фенотипах CYP, но с одинаковым фенотипом EPHX. NM / NM был выбран в качестве контрольной группы, независимо от активности EPXH. Следовательно, что касается промежуточного фенотипа EPHX, только группа PM / NM имела значительную разницу как для [PHT], так и для [p-HPPH] (p <0.01). Учитывая повышенную активность EPHX, группа IM / IM показала значительную разницу только для PHT (p <0,01). Наконец, принимая во внимание сниженную активность EPHX, только группа IM / IM значительно отличалась от контрольной в [PHT] (p <0,001).

3. Обсуждение.

Частоты генотипа CYP2C9, обнаруженные в этом исследовании, напоминают частоты, указанные Lee et al. Среди кавказских популяций. [7]. Тем не менее, частота CYP2C19 * 2 оказалась выше, чем у европеоидной расы, но ниже дозы, сообщенной Alonso-Navarro et al. Для азиатской популяции., [26]. Следует отметить, что CYP2C19 * 3 не был обнаружен в этой уругвайской популяции. Аллельный вариант CYP2C19, связанный с повышением активности фермента, обозначен * 17. Хотя было проведено несколько исследований, включающих этот вариант, обнаруженные частоты аллелей составили 18% у шведов, 19,6% у греков, 18% у эфиопов и 4% у китайцев. Однако были получены противоречивые результаты в отношении величины эффекта, который может иметь CYP2C19 * 17. Принимая это во внимание и в дополнение к тому факту, что, как было упомянуто во вводном разделе, на CYP2C9 приходится 90% пара-гидроксилирования, вариант CYP2C19 * 17 не рассматривался в этом исследовании [27,28,29,30] .Что касается EPHX, частота генотипов, обнаруженная в этом исследовании для гетерозиготного Tyr113, была сходной, в то время как для гомозиготного His113 была выше, чем у представителей европеоидной популяции. Частоты гетерозигот по His139 и гомозигот по Arg139 были ниже и аналогичны, соответственно, чем те, о которых сообщалось среди европеоидов [9,17]. Сравнения в [PHT] проводились между различными парными фенотипами CYP2C9 / CYP2C19. Группы NM / IM и IM / NM, в которых наблюдается умеренное или умеренное снижение активности фермента CYP2C19 и CYP2C9, соответственно, сравнивались между ними и с группой с наивысшей активностью фермента (NM / NM дикого типа) .Хотя не было получено существенной разницы ни в одном из сравнений, следует отметить, что [PHT] в группе NM / IM остался неизменным, несмотря на снижение активности CYP2C19, в то время как в группе IM / NM [PHT] был выше не только при сравнении с группой NM / NM (на 18% выше), но также и с группой NM / IM (на 17% выше). Согласно этим результатам, можно сказать, что метаболизм PHT не может быть затронут, когда снижается только активность CYP2C19 из-за того, что CYP2C9, который, как сообщается, играет преобладающую роль в метаболизме PHT [4], способен компенсировать снижение активности CYP2C19.С другой стороны, когда активность CYP2C9 снижается, CYP2C19 не может ее компенсировать, и наблюдается повышенное [PHT] из-за пониженного клиренса PHT. Эти наблюдения подтверждают вторичную роль CYP2C19 в метаболическом пути PHT.

Однако, когда была проанализирована группа IM / IM, было обнаружено, что [PHT] значительно выше (81% относительно NM / NM), показывая значительную разницу (p <0,001) по сравнению с фенотипом дикого типа и с группами. в котором только один из ферментов имел пониженную активность.Эти результаты показывают резкое снижение клиренса PHT, когда оба CYP снижают свою активность, подтверждая идею о том, что CYP2C19 играет второстепенную роль в метаболизме PHT.

[p-HPPH] также сравнивали среди фенотипов CYP2C9 / CYP2C19, и увеличение было замечено при сравнении группы NM / IM с группой NM / NM. Это увеличение [p-HPPH], даже незначительное, может быть связано с уменьшением клиренса пути p-HPPH → катехол, который катализируется CYP2C19 среди других CYP.Кроме того, тот факт, что [PHT] остался неизменным, свидетельствует о том, что CYP2C19 может быть более вовлечен в p-HPPH, чем в биотрансформацию PHT. Более того, CYP2C9 не способен компенсировать снижение активности CYP2C19, что дает некоторые доказательства вторичной роли CYP2C9 в биотрансформации p-HPPH. Для подтверждения показанной здесь тенденции потребуется большее количество испытуемых.

Следует иметь в виду, что концентрация метаболита зависит не только от его клиренса, но и от его биодоступности.Единственный случай, когда женщина с фенотипом PM / NM показала значительное снижение активности фермента CYP2C9, усиливает наши подозрения. Несмотря на то, что она является нормальным метаболизатором CYP2C19, у нее, по-видимому, был самый высокий [PHT] (значительное увеличение на 93% по сравнению с группой NM / NM). Поскольку CYP2C19 не был способен метаболизировать PHT, как CYP2C9, снижение клиренса PHT должно приводить к самому высокому уровню PHT, даже выше, чем в группе IM / IM. Однако значительное снижение [p-HPPH] (61% по сравнению с группой NM / NM) могло быть совместимо только с более низкой биодоступностью p-HPPH, поскольку его клиренс должен оставаться неизменным из-за постоянства активности CYP2C19 (NM и НМ).

Еще раз, группа IM / IM показала 68% снижение [p-HPPH] по сравнению с фенотипом дикого типа NM / NM (p = 0,01). Причиной здесь должна быть сниженная биодоступность p-HPPH, поскольку предполагается, что его клиренс даже ниже, чем в группе дикого типа. Интересно, что PM / NM и IM / IM имели промежуточную и повышенную активность EPHX, соответственно.

Чтобы оценить роль, которую EPHX играет в биодоступности p-HPPH, были проанализированы концентрации метаболитов в плазме с учетом фенотипа трех ферментов вместе: CYP2C9, CYP2C19 и EPHX.Как только ареноксид образуется, он может элиминироваться двумя способами: p-HPPH или образование дигидродиола. Если фермент, приводящий к образованию дигидродиола (EPHX), имеет повышенную активность, ожидается уменьшение пути образования p-HPPH и, следовательно, [p-HPPH]. И наоборот, если активность EPHX снижается, образование дигидродиола снижается, что приводит к увеличению [p-HPPH].

Не было обнаружено значительных различий в [p-HPPH] среди трех групп, в которых фенотип для обоих CYP был NM, но активность EPHX варьировалась от повышенной до промежуточной и до пониженной.Однако снижение среднего [p-HPPH] на 66% наблюдалось в группе NM / NM / Повышенное по сравнению с группой NM / NM / Intermediate дикого типа. Возможно, количества испытуемых было недостаточно, чтобы достичь значимости, несмотря на большую разницу между средствами. С другой стороны, повышение уровня p-HPPH на 6% наблюдалось в группе NM / NM / Decreased по сравнению с фенотипом дикого типа. Эти результаты не подтверждают, но подтверждают роль EPHX в воздействии p-HPPH.

Некоторые интересные открытия, касающиеся [PHT], также заслуживают того, чтобы сообщить о них.Несмотря на то, что средние значения [PHT] существенно не различались, их значения распределяются по широкому диапазону в следующем порядке: уменьшенные или промежуточные> увеличенные относительно фенотипа EPHX. Это может свидетельствовать о каком-то обратимом образовании ареноксида, с помощью которого исходное лекарственное средство PHT может быть восстановлено, когда трансформация промежуточного метаболита затруднена. Хотя об этом пути для PHT никогда не сообщалось, восстановление оксида арена обратно до исходного соединения было впервые изучено Booth et al., [31]. Анализируя метаболизм бенз [a] антрацена у крыс, авторы доказали, что происходит восстановление бенз [a] антрацена 5,6-оксида до исходного углеводорода, который является микросомальной эпоксидредуктазой, ферментом, опосредующим реакцию. Более того, авторы сообщили, что количество исходного углеводорода, образованного восстановлением ареноксида, увеличивалось в анаэробных условиях или при добавлении ингибитора EPHX, такого как оксид циклогексена. Следовательно, нельзя пренебрегать участием эпоксидредуктазы в метаболизме PHT-ареноксида.Часть пути биотрансформации PHT, описанная в разделе «Введение», теперь может быть дополнена нашими результатами, как показано на рисунке 1.

В заключение, CYP2C9, по-видимому, играет преобладающую роль в биотрансформации PHT и второстепенную роль в биотрансформации p-HPPH, поскольку он не способен метаболизировать p-HPPH в той же степени, что и CYP2C19. С другой стороны, CYP2C19, по-видимому, играет преобладающую роль в биотрансформации фазы I p-HPPH и второстепенную роль в биотрансформации PHT, поскольку он не способен метаболизировать PHT как CYP2C9.Следует учитывать, что p-HPPH также следует метаболизму фазы II, но этот путь выведения не был генотипирован. Наконец, EPHX, по-видимому, определяет биодоступность p-HPPH. Ограничением этого исследования является небольшое количество пациентов, включенных для получения достаточной статистической мощности. Однако это число отражает небольшое количество пациентов, получающих монотерапию PHT или другими противоэпилептическими препаратами, не являющимися индукторами.

Эпоксидгидролаза 1 (EPHX1) гидролизует эпоксиэйкозаноиды и ухудшает восстановление сердца после ишемии.

Стимулы, такие как воспаление или гипоксия, индуцируют опосредованное цитохромом P450 эпоксигеназу продукцию эпоксиэикозатриеновой кислоты, производной от арахидоновой кислоты.EET обладают кардиозащитным, сосудорасширяющим, ангиогенным, противовоспалительным и обезболивающим действием, которые уменьшаются гидролизом EET с образованием биологически менее активных дигидроксиэйкозатриеновых кислот (DHET). Предыдущие анализы in vitro и показали, что эпоксидгидролаза 2 (EPHX2) ответственна почти за весь гидролиз EET. EPHX1, который демонстрирует медленный гидролиз EET in vitro , как полагают, вносит лишь незначительный вклад в гидролиз EET. Используя мыши Ephx1 — / — , Ephx2 — / — и Ephx1 — / — Ephx2 — / — , мы показываем, что EPHX1 значительно способствует гидролизу EET в vivo .Нарушение генов Ephx1 и / или Ephx2 не вызывало компенсаторных изменений в экспрессии других генов Ephx или эпоксигеназ семейства CYP2 . Уровни в плазме 8,9-, 11,12- и 14,15-DHET были снижены на 38, 44 и 67% у мышей Ephx2 — / — по сравнению с мышами дикого типа (WT), соответственно; однако в плазме мышей Ephx1 — / — Ephx2 — / — наблюдалось значительно большее снижение (100, 99 и 96%) этих соответствующих DHET.Кинетические анализы и эксперименты с FRET показали, что EPHX1 является медленным поглотителем EET, но гидролизует EET в связанной реакции с цитохромом P450, чтобы ограничить базальные уровни EET. Более того, мы также обнаружили, что активность EPHX1 является биологически значимой, поскольку сердца Ephx1 — / — Ephx2 — / — имели значительно лучшее постишемическое функциональное восстановление (71%), чем у WT (31%) и Ephx2. — / — (51%) червей. Эти результаты показывают, что мыши Ephx1 — / — Ephx2 — / — представляют собой ценную модель для оценки опосредованных EET эффектов, раскрывают новую парадигму метаболизма EET и предполагают, что двойное ингибирование EPHX1 и EPHX2 может представлять терапевтический подход к лечению патологий человека, таких как инфаркт миокарда.

% PDF-1.4 % 54 0 объект > эндобдж xref 54 414 0000000016 00000 н. 0000008629 00000 н. 0000010808 00000 п. 0000011043 00000 п. 0000011295 00000 п. 0000011808 00000 п. 0000012110 00000 п. 0000012640 00000 п. 0000012904 00000 п. 0000013369 00000 п. 0000013818 00000 п. 0000014108 00000 п. 0000014522 00000 п. 0000014892 00000 п. 0000015274 00000 п. 0000015795 00000 п. 0000016143 00000 п. 0000016533 00000 п. 0000016919 00000 п. 0000017336 00000 п. 0000017810 00000 п. 0000018207 00000 п. 0000018552 00000 п. 0000018810 00000 п. 0000019087 00000 п. 0000019559 00000 п. 0000019839 00000 п. 0000020172 00000 п. 0000020417 00000 п. 0000020766 00000 п. 0000020948 00000 н. 0000021278 00000 п. 0000021564 00000 п. 0000021961 00000 п. 0000022340 00000 п. 0000022505 00000 п. 0000022687 00000 п. 0000023176 00000 п. 0000023748 00000 п. 0000024328 00000 п. 0000024701 00000 п. 0000025096 00000 п. 0000025397 00000 п. 0000025823 00000 п. 0000026257 00000 п. 0000026547 00000 п. 0000027003 00000 п. 0000027416 00000 п. 0000027564 00000 п. 0000028624 00000 п. 0000029739 00000 п. 0000030008 00000 п. 0000030383 00000 п. 0000030922 00000 п. 0000031382 00000 п. 0000031978 00000 п. 0000032551 00000 п. 0000033026 00000 п. 0000033432 00000 п. 0000033749 00000 п. 0000033965 00000 п. 0000034421 00000 п. 0000034686 00000 п. 0000034856 00000 п. 0000035074 00000 п. 0000035512 00000 п. 0000035839 00000 п. 0000036316 00000 п. 0000036604 00000 п. 0000036962 00000 п. 0000037268 00000 п. 0000037626 00000 п. 0000038074 00000 п. 0000038701 00000 п. 0000038993 00000 п. 0000039037 00000 н. 0000039266 00000 п. 0000039570 00000 п. 0000040059 00000 п. 0000040384 00000 п. 0000040683 00000 п. 0000040954 00000 п. 0000041459 00000 п. 0000041856 00000 п. 0000042206 00000 п. 0000042811 00000 п. 0000043207 00000 п. 0000043697 00000 п. 0000044202 00000 п. 0000044455 00000 п. 0000044790 00000 н. 0000045177 00000 п. 0000045477 00000 п. 0000046006 00000 п. 0000046399 00000 п. 0000046666 00000 п. 0000046710 00000 п. 0000046893 00000 п. 0000047265 00000 п. 0000047616 00000 п. 0000048008 00000 н. 0000048384 00000 п. 0000048787 00000 н. 0000049046 00000 н. 0000049348 00000 п. 0000049649 00000 н. 0000049842 00000 п. 0000050001 00000 п. 0000050283 00000 п. 0000050629 00000 п. 0000050839 00000 п. 0000051061 00000 п. 0000051278 00000 п. 0000051747 00000 п. 0000052167 00000 п. 0000052742 00000 н. 0000053174 00000 п. 0000053218 00000 п. 0000053489 00000 п. 0000053779 00000 п. 0000054073 00000 п. 0000054366 00000 п. 0000054750 00000 п. 0000054936 00000 п. 0000055144 00000 п. 0000055349 00000 п. 0000055594 00000 п. 0000055764 00000 п. 0000056031 00000 п. 0000056265 00000 п. 0000056847 00000 п. 0000057343 00000 п. 0000057879 00000 п. 0000058348 00000 п. 0000058870 00000 п. 0000059215 00000 п. 0000059675 00000 п. 0000060085 00000 п. 0000060473 00000 п. 0000060861 00000 п. 0000061094 00000 п. 0000061615 00000 п. 0000062177 00000 п. 0000062650 00000 п. 0000062974 00000 п. 0000062996 00000 п. 0000063825 00000 п. 0000063847 00000 п. 0000064724 00000 н. 0000065102 00000 п. 0000065523 00000 п. 0000065968 00000 п. 0000066401 00000 п. 0000066921 00000 п. 0000067398 00000 п. 0000067690 00000 н. 0000068006 00000 п. 0000068321 00000 п. 0000068718 00000 п. 0000069155 00000 п. 0000069573 00000 п. 0000070140 00000 п. 0000070433 00000 п. 0000070770 00000 п. 0000070980 00000 п. 0000071524 00000 п. 0000071718 00000 п. 0000072138 00000 п. 0000072415 00000 п. 0000072659 00000 п. 0000072904 00000 н. 0000072948 00000 н. 0000073632 00000 п. 0000073866 00000 п. 0000074176 00000 п. 0000074386 00000 п. 0000074570 00000 п. 0000074895 00000 п. 0000075411 00000 п. 0000075662 00000 п. 0000076047 00000 п. 0000076328 00000 п. 0000076770 00000 п. 0000077019 00000 п. 0000077301 00000 п. 0000077345 00000 п. 0000077664 00000 п. 0000077962 00000 п. 0000078369 00000 п. 0000078692 00000 п. 0000079093 00000 п. 0000079529 00000 п. 0000079956 00000 н. 0000080284 00000 п. 0000080745 00000 п. 0000081317 00000 п. 0000081692 00000 п. 0000082078 00000 п. 0000082517 00000 п. 0000082939 00000 п. 0000083232 00000 п. 0000083628 00000 п. 0000084174 00000 п. 0000084705 00000 п. 0000085116 00000 п. 0000085734 00000 п. 0000085901 00000 п. 0000086203 00000 п. 0000087760 00000 п. 0000088914 00000 п. 00000 00000 п. 00000

00000 п. 00000 00000 п. 0000093255 00000 п. 0000093805 00000 п. 0000094789 00000 п. 0000095401 00000 п. 0000096524 00000 п. 0000097838 00000 п. 0000099010 00000 н. 0000099477 00000 н. 0000099681 00000 п. 0000099832 00000 н. 0000100003 00000 н. 0000101935 00000 н. 0000102103 00000 п. 0000102351 00000 п. 0000103053 00000 н. 0000103698 00000 п. 0000105112 00000 н. 0000106267 00000 н. 0000106662 00000 н. 0000107114 00000 п. 0000108680 00000 п. 0000108869 00000 н. 0000110633 00000 п. 0000111002 00000 н. 0000112019 00000 н. 0000113724 00000 н. 0000113977 00000 н. 0000114861 00000 н. 0000115220 00000 н. 0000115504 00000 н. 0000116278 00000 н. 0000116682 00000 н. 0000117966 00000 п. 0000118319 00000 п. 0000118893 00000 н. 0000119638 00000 н. 0000120213 00000 н. 0000120622 00000 н. 0000121789 00000 н. 0000123360 00000 н. 0000124739 00000 н. 0000124783 00000 н. 0000124999 00000 н. 0000125365 00000 н. 0000126154 00000 н. 0000126660 00000 н. 0000127234 00000 н. 0000127941 00000 п. 0000128229 00000 н. 0000129738 00000 н. 0000130742 00000 н. 0000131059 00000 н. 0000131525 00000 н. 0000131946 00000 н. 0000133038 00000 н. 0000134284 00000 н. 0000135865 00000 н. 0000136329 00000 н. 0000136553 00000 н. 0000136708 00000 н. 0000137073 00000 н. 0000137117 00000 н. 0000137378 00000 н. 0000137796 00000 н. 0000138426 00000 н. 0000138591 00000 н. 0000138780 00000 н. 0000140049 00000 н. 0000141192 00000 н. 0000142100 00000 н. 0000143215 00000 н. 0000144614 00000 н. 0000146102 00000 п. 0000146428 00000 н. 0000146638 00000 п. 0000146909 00000 н. 0000147158 00000 н. 0000147320 00000 н. 0000148454 00000 н. 0000148836 00000 н. 0000149142 00000 п. 0000149505 00000 н. 0000149652 00000 н. 0000150053 00000 н. 0000150328 00000 н. 0000150580 00000 н. 0000150787 00000 н. 0000151113 00000 н. 0000151363 00000 н. 0000151700 00000 н. 0000152021 00000 н. 0000152348 00000 н. 0000153019 00000 н. 0000153368 00000 н. 0000153524 00000 н. 0000154216 00000 н. 0000154260 00000 н. 0000154595 00000 н. 0000156612 00000 н. 0000156766 00000 н. 0000157017 00000 н. 0000158129 00000 н. 0000159832 00000 н. 0000160428 00000 н. 0000160737 00000 н. 0000162163 00000 н. 0000163269 00000 н. 0000163617 00000 н. 0000165252 00000 н. 0000165421 00000 н. 0000165847 00000 н. 0000166168 00000 н. 0000166769 00000 н. 0000167895 00000 н. 0000168049 00000 н. 0000169611 00000 н. 0000170808 00000 н. 0000171448 00000 н. 0000171756 00000 н. 0000172214 00000 н. 0000172605 00000 н. 0000173865 00000 н. 0000174487 00000 н. 0000175891 00000 н. 0000176352 00000 н. 0000176375 00000 н. 0000177495 00000 н. 0000177878 00000 н. 0000178326 00000 н. 0000178654 00000 н. 0000179156 00000 н. 0000179528 00000 н. 0000180030 00000 н. 0000180475 00000 н. 0000180858 00000 н. 0000181207 00000 н. 0000181625 00000 н. 0000182069 00000 н. 0000182525 00000 н. 0000183106 00000 н. 0000183415 00000 н. 0000183717 00000 н. 0000184136 00000 н. 0000184284 00000 н. 0000185145 00000 н. 0000185811 00000 н. 0000186132 00000 н. 0000186542 00000 н. 0000187087 00000 н. 0000187420 00000 н. 0000187755 00000 н. 0000188078 00000 н. 0000188446 00000 н. 0000188826 00000 н. 0000189316 00000 н. 0000189597 00000 н. 0000189843 00000 н. 00001

00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 00001

00000 н. 00001

00000 н. 00001

00000 н. 00001

00000 н. 0000192822 00000 н. 0000193087 00000 н. 0000193618 00000 н. 0000194005 00000 н. 0000194296 00000 н. 0000194712 00000 н. 0000195043 00000 н. 0000195333 00000 н. 0000195808 00000 н. 0000196274 00000 н. 0000196725 00000 н. 0000197123 00000 н. 0000197146 00000 н. 0000198316 00000 н. 0000198339 00000 н. 0000199521 00000 н. 0000199544 00000 н. 0000200733 00000 н. 0000201736 00000 н. 0000202439 00000 н. 0000202855 00000 н. 0000202920 00000 н. 0000203003 00000 п. 0000203047 00000 н. 0000203271 00000 н. 0000203294 00000 н. 0000204430 00000 н. 0000204452 00000 н. 0000205456 00000 н. 0000205535 00000 н. 0000008702 00000 н. 0000010785 00000 п. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 55 0 объект > эндобдж 466 0 объект > поток HgPi! ! WH)! HYK!

Миссенс-генетические полиморфизмы микросом (EPHX1) и растворимого эпоксида

Введение

Инсульт, вторая по значимости причина смерти после ишемической болезни сердца во всем мире, характеризуется потерей одной или нескольких функций организма из-за недостаточного кровоснабжения мозга.Ишемический инсульт — наиболее распространенный тип, на который приходится более 80% всех случаев, и возникает в результате закупорки кровеносного сосуда, по которому кровь поступает в мозг. 1 Если обструкция возникает из-за тромба, который образуется на атеросклеротической бляшке внутри кровеносного сосуда в головном мозге, этот подтип называется атеротромботическим ишемическим инсультом. Механизмы, лежащие в основе ишемического инсульта, полностью не объяснены. 2,3

Эпоксиэйкозатриеновые кислоты (EET) представляют собой сигнальные молекулы, полученные из 20-углеродной полиненасыщенной жирной кислоты арахидоновой кислоты.EET демонстрируют широкий спектр потенциально полезных действий при инсульте, включая вазодилатацию, нейрозащиту и стимуляцию ангиогенеза, а также подавление агрегации тромбоцитов, окислительного стресса и постишемического воспаления. Как и другие эпоксиды, EET метаболизируются до их предположительно менее активной формы, дигидроксиэйкозатриеновых кислот (DHET), ферментами эпоксидгидролазы. 4

Существует два основных эпоксидных гидролаза: микросомальные и растворимые. Эпоксидгидролаза микросом (mEH, EPHX1 , EC 3.3.2.9) является важным ферментом биотрансформации, который катализирует метаболизм различных ксенобиотических эпоксидных субстратов и полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), включая канцерогенные и мутагенные соединения в табачном дыме, в более полярные метаболиты диолов. Эти мутагены стимулируют образование аддуктов ДНК, которые, помимо канцерогенеза, приводят к генетическим изменениям в кровеносных сосудах. 5 Исследования на животных показали, что мутагены табачного дыма, такие как ПАУ и гетероциклические амины, непосредственно увеличивают развитие атеросклеротических поражений. 6 Таким образом, активность мЭГ может изменять уровни атерогенной ЛАГ и риск ишемического инсульта. Более того, mEH также играет роль в метаболизме EET. Хотя sEH опосредует основную часть метаболизма EET, значительный вклад mEH наблюдался в мозге мышей, указывая на новую роль этого фермента в регуляции физиологических процессов. 7 Два бессмысленных однонуклеотидных полиморфизма (SNP) в гене EPHX1 приводят к критическим аминокислотным заменам.rs1051740T> C SNP (Tyr113His) расположен в экзоне 3 гена, и полиморфный аллель изменяет кодон с тирозина на гистидин в 113-м положении. Наличие остатка гистидина вместо тирозина приводит к снижению активности фермента на 39%. 8 Другой миссенс-SNP (rs2234922A> G) расположен в экзоне 4 и вызывает замену аминокислоты с гистидина на аргинин в 139-м положении (His139Arg). Было показано, что His139Arg приводит к увеличению активности фермента на 25%. 8 Ассоциативные исследования показали, что полиморфизмы в гене EPHX1 могут быть важными факторами риска предрасположенности к различным видам рака; 9–12 однако генетический полиморфизм EPHX1 ранее не исследовался в отношении ишемического инсульта.

Растворимая эпоксидгидролаза (sEH, EC 3.3.2.10) является основным ферментом, который играет роль в превращении EET в метаболиты диола. 13,14 Ингибиторы sEH продемонстрировали защиту от сердечно-сосудистых и ишемических повреждений головного мозга на животных моделях. 15 Миссенс-SNP в экзоне 8 гена, кодирующего sEH ( EPHX2 ) (rs751141G> A), вызывает замену аминокислоты с Arg на Gln в положении 287 фермента, что приводит к значительному снижению активности sEH (25–58% от фермента дикого типа) in vitro. 16 sEH вариант Arg287Gln обладает защитным эффектом против ишемического повреждения нейронов. 17 Этот результат частично совпадает с предполагаемым влиянием активности sEH на биодоступность EET. 18,19 В других популяциях было проведено несколько предыдущих исследований взаимосвязи между EPHX2 и сердечно-сосудистыми заболеваниями, включая риск ишемического инсульта; 20–25 Однако эта взаимосвязь ранее не исследовалась в турецкой популяции.

Хорошо известно, что частоты полиморфных аллелей различаются среди популяций с разной этнической принадлежностью. Таким образом, насколько нам известно, это исследование впервые проанализировало связь между полиморфизмами Tyr113His и His139Arg EPHX1 с риском ишемического инсульта.Более того, ассоциация полиморфизма Arg287Gln EPHX2 с риском ишемического инсульта была впервые исследована в турецкой популяции.

Материалы и методы

Объекты

Образцы крови 237 пациентов с атеросклеротическим ишемическим инсультом крупных артерий (138 мужчин и 99 женщин) и 120 человек из контрольной группы без симптомов (56 мужчин и 64 женщины), которые не были родственниками, кавказцы, были собраны в Центральной Анатолии, Турция, в сотрудничестве Медицинской академии Гюльхане, отделение неврологии, Анкара, Турция.Все участники были проинформированы об исследовании и были получены подписанные формы информированного согласия. Это исследование было одобрено этическим комитетом Медицинской академии Гюльхане и проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации 1964 года и более поздними поправками к ней или сопоставимыми этическими стандартами. 26 Все лабораторные исследования проводились без учета медицинских условий субъектов.

Детали критериев включения и исключения были такими, как описано ранее. 27,28 Вкратце, в это исследование были включены пациенты с атеротромботическим ишемическим инсультом. Первоначальный диагноз инфаркта мозга был поставлен на основании неврологического обследования и компьютерной томографии головного мозга (КТ), а затем были выполнены трансторакальное эхокардиографическое исследование, холтеровское исследование и процедура обнаружения транскраниальной допплерографии для исключения источников эмболии. Критерием включения в исследование были пациенты, перенесшие инсульт переднего кровообращения. Группа «болезни крупных сосудов», описанная в исследовании ORG 10172 в лечении острого инсульта (TOAST), в дополнение к группам «тотальный передний инфаркт» и «частичный передний инфаркт кровообращения», описанным в проекте Oxfordshire Community Stroke Project (OCSP), были выбраны в качестве кейсов.

Критерии исключения включали наличие других серьезных заболеваний, включая аутоиммунные заболевания, коагулопатии, новообразования, почечную или печеночную недостаточность, любой известный источник эмболии (дуга аорты, сердечная или сонная артерия), семейный анамнез гематологических, аутоиммунных или хронических воспалительных заболеваний и инфаркт миокарда в анамнезе в течение 3 недель или транзиторная ишемическая атака или инсульт в любое время.

Контрольные субъекты были отобраны случайным образом из неврологических амбулаторий из лиц, у которых никогда не было инсульта или транзиторной ишемической атаки, или стеноза сонной артерии (сужение просвета)> 50% или изъязвления сонной бляшки.Все критерии исключения были точно применены к контролю.

Как в случаях, так и в контрольной группе была представлена ​​подробная история обычных факторов риска и состояний сосудов. Кроме того, они прошли стандартные лабораторные анализы, включая общий анализ крови, дифференциальный подсчет лейкоцитов и скорость оседания эритроцитов; стандартные биохимические тесты, включая глюкозу натощак, липидный профиль (триглицериды, общий холестерин, липопротеины низкой плотности [ЛПНП] -холестерин и липопротеины высокой плотности [ЛПВП] -холестерин), креатинин, натрий, калий, билирубин, функциональные тесты печени, стандартные анализы мочи и скрининговые ревматологические тесты; электрокардиограмма и рентген грудной клетки.

Определение генотипа

Для выделения ДНК из образцов цельной крови субъектов использовался протокол выделения ДНК путем высаливания вручную с небольшими модификациями. 29 Вкратце, 750 мкл буфера TKM (10 мМ буфер Trizma pH 7,6, содержащий 10 мМ KCl, 2 мМ EDTA и 4 мМ MgCl 2 ) добавляли к 750 мкл общей крови. Затем в пробирку добавляли 20 мкл Triton X-100 и раствор перемешивали, несколько раз переворачивая для лизиса клеток. Центрифугирование проводили при 1000 × g при комнатной температуре (25 ° C) на настольной микроцентрифуге Sigma 1–15 (Sigma, Osterode am Harz, Германия) в течение 10 мин.После центрифугирования наблюдали две фазы; осадок, содержащий ДНК, был сохранен, и были выполнены еще две стадии промывки буфером TKM. Конечный осадок ресуспендировали в 200 мкл буфера TKM, а затем добавляли 10 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS). Суспензию тщательно перемешивали и инкубировали при 58 ° C в течение 10 мин. Затем добавляли 75 мкл холодного насыщенного NaCl, что приводило к осаждению белков. Затем центрифугирование проводили при 14000 × g в течение 10 мин при 4 ° C.ДНК-содержащий супернатант переносили в чистую пробирку и добавляли 2-кратный объем ледяного абсолютного этанола для осаждения ДНК. Пробирку несколько раз переворачивали, выдерживали при -20 ° C не менее 30 мин, а затем центрифугировали при 10 000 × g в течение 10 мин при 4 ° C. Супернатант удаляли, а осадок, содержащий ДНК, сушили до полного удаления этанола и растворяли в 100 мкл буфера ТЕ, pH 8,0. Затем пробирку инкубировали при 37 ° C в течение не менее 2 часов.

Генотипирование для всех полиморфизмов проводили с использованием метода полиморфизма длины рестрикционного фрагмента полимеразной цепной реакции (ПЦР-ПДРФ).Определение генотипов полиморфизма Tyr113His (rs1051740T> C) для EPHX1 включало начальную амплификацию участка длиной 200 п.н. в экзоне 3 гена. Смесь для ПЦР содержала 1 × буфер для амплификации, 1,25 мМ MgCl 2 , смесь 200 мкМ dNTP, 40 пмоль каждого праймера, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq и приблизительно 200 нг ДНК-матрицы. Последовательности прямого и обратного праймеров были 5ʹ-GGGGTCCTGAATTTTTGCTCC-3ʹ и 5ʹ-CAATCTTAGTCTTGAAGTGACGGT-3ʹ соответственно. 30 Праймеры проверяли на предмет связывания с областью экзона 3 гена EPHX1 с использованием веб-инструмента Primer-BLAST. 31 ПЦР проводили с использованием термоциклера Techne TC-4000 (Techne, Даксфорд, Кембридж, Великобритания) со следующими условиями термоциклирования: начальная денатурация при 95 ° C в течение 5 минут с последующими 35 циклами денатурации при 95 ° C. C в течение 1 мин, отжиг при 55 ° C в течение 1 мин и удлинение при 72 ° C в течение 1 мин. Три единицы эндонуклеазного рестрикционного фермента PsyI ( Tth211 ) (MBI Fermentas, США) использовали для переваривания продуктов ПЦР длиной 200 п.о., и результаты анализировали на 2,5% агарозном геле (рис. 1).Одна полоса из 200 п.н. представляет собой картину полос гомозиготного генотипа дикого типа (TT или 113Tyr / 113Tyr), тогда как две полосы из 177 и 23 п.н. представляют гомозиготный полиморфный генотип (CC или 113His / 113His). Картина полос гетерозиготного генотипа (TC или 113Tyr / 113His) состоит из трех полос на 200, 177 и 23 п.н.

Рисунок 1 Изображение геля агарозы, показывающее характерные образцы полос для определения генотипов для полиморфизма EPHX1 Tyr113His (rs1051740T> C).Фрагмент 200 п.н. в экзоне 3 гена EPHX1 амплифицировали с помощью ПЦР, а затем продукт ПЦР подвергали расщеплению эндонуклеазой рестрикции с помощью PsyI ( Tth211 ). Продукты расщепления разделяли электрофорезом в 2,5% агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия, и полосы ДНК визуализировали УФ-освещением. Дорожку, помеченную L, загружали лестницей ДНК (от 1000 до 50 п.н.). Дорожки 2 и 4 содержат полосу в 200 п.н., которая представляет картину полос гомозиготного генотипа дикого типа (TT или 113Tyr / 113Tyr).Дорожка 3 содержит две полосы на 177 и 23 п.н., показывающие картину полос гомозиготного полиморфного генотипа (CC или 113His / 113His). Дорожки 1 и 5 показывают картину полос гетерозиготного генотипа (TC или 113Tyr / 113His), который, как и ожидалось, состоит из трех полос на 200, 177 и 23 п.н.

Фрагменты ПЦР для полиморфизма His139Arg (rs2234922A> G) на EPHX1 были получены с использованием следующей пары праймеров: прямой 5ʹ-ACATCCACTTCATCCACGT-3ʹ и обратный 5ʹ-ATGCCTCTGAGAAGCCAT-3ʹ. 32 Праймеры проверяли на предмет связывания с областью экзона 4 гена EPHX1 с использованием веб-инструмента Primer-BLAST. 31 ПЦР выполняли, как описано для полиморфизма Tyr113His того же гена. Ожидаемая длина продукта ПЦР составляла 210 п.н. Расщепление рестрикционной эндонуклеазой с использованием 10 единиц RsaI (MBI Fermentas, США) выполняли для каждого продукта ПЦР с правильной длиной полосы, и результаты анализировали на 2,5% агарозном геле (рис. 2). В результате переваривания был получен один непереваренный фрагмент длиной 210 ​​п.н. для гомозиготного генотипа дикого типа (AA или 139His / 139His) и фрагменты длиной 163 и 47 п.н. для гомозиготного полиморфного генотипа (GG или 139Arg / 139Arg).Три полосы показали, что человек был гетерозиготным по полиморфизму His139Arg (AG или 139His / 139Arg).

Рисунок 2 Изображение геля агарозы, показывающее характерные образцы полос для определения генотипов для полиморфизма EPHX1 His139Arg (rs2234922A> G). Фрагмент 210 п.н. в экзоне 4 гена EPHX1 амплифицировали с помощью ПЦР, а затем продукт ПЦР подвергали расщеплению эндонуклеазой рестрикции с помощью RsaI .Продукты расщепления разделяли электрофорезом в 2,5% агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия, и полосы ДНК визуализировали УФ-освещением. Дорожку, помеченную L, загружали лестницей ДНК (от 1000 до 50 п.н.). Дорожки 2 и 5 содержат полосу в 210 п.н., которая представляет картину полос гомозиготного генотипа дикого типа (AA или 139His / 139His). Дорожка 4 содержит две полосы, 164 и 46 п.н. (полоса 46 п.н. находилась в самом конце геля, которую невозможно сфотографировать), демонстрируя картину полос гомозиготного полиморфного генотипа (GG или 139Arg / 139Arg).Дорожки 1 и 3 показывают картину полос гетерозиготного генотипа (AG или 139His / 139Arg), который, как и ожидалось, состоит из трех полос 210, 164 и 46 п.н.

Для определения генотипов полиморфизма EPHX2 Arg287Gln (rs751141G> A) проводили ПЦР с использованием 20 пмоль каждого из следующих праймеров: прямой 5ʹ-AGGAGGGTGACTCCTAGACCT-3ʹ и обратный 5ʹGGCCAGTAGTAGACCT-3ʹ и обратный 5GGCCAGCAGTAGACCT-3ʹ × буфер для ПЦР, 2 мМ MgCl 2 , 200 мкМ dNTP, 1,5 ед. ДНК-полимеразы Taq (MBI Fermentas, США) и около 200 нг геномной ДНК в 50 мкл общего реакционного объема.Праймеры были разработаны с использованием веб-инструмента Primer-BLAST. 31 Условиями ПЦР были: начальная денатурация при 95 ° C в течение 2 минут, затем 32 цикла денатурации при 95 ° C в течение 15 секунд, отжиг при 55 ° C в течение 30 секунд и удлинение при 72 ° C в течение 30 секунд, и заключительный этап удлинения при 72 ° C в течение 3 мин. Ожидаемая длина продуктов ПЦР составляла 683 п.н., содержащих три или два сайта узнавания для рестрикционного фермента MspI (MBI Fermentas, США), в зависимости от присутствия G или A на сайте SNP, соответственно.Таким образом, инкубация продукта ПЦР длиной 683 п.н. с 4-ю единицами MspI привела к четырем фрагментам 244, 237, 152 и 50 п.н. для аллеля G, которые выглядели как три полосы при электрофорезе в 2,5% агарозном геле, поскольку 244- Полосы п.н. и 237 п.н. различить не удалось (рис. 3). С другой стороны, три фрагмента длиной 244, 237 и 202 п.н. были получены для аллеля А, что дало две полосы при электрофорезе в агарозном геле. Продукты расщепления, полученные из гетерозигот (GA или 287Arg / 287Gln), содержат фрагменты длиной 244, 237, 202, 152 и 50 п.н .; тем не мение.полосы длиной 244 п.о. и 237 п.о. не были различимы при разделении на 2,5% агарозном геле и, таким образом, выглядели как более темная одиночная полоса.

Рисунок 3 Изображение геля агарозы, показывающее характерные образцы полос для определения генотипов для полиморфизма EPHX2 Arg287Gln (rs751141G> A). Фрагмент длиной 683 п.н. в экзоне 8 гена EPHX2 амплифицировали с помощью ПЦР, а затем продукт ПЦР подвергали расщеплению эндонуклеазой рестрикции с помощью MspI .Продукты расщепления разделяли электрофорезом в 2,5% агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия, и полосы ДНК визуализировали УФ-освещением. Дорожку, помеченную L, загружали лестницей ДНК (от 1000 до 50 п.н.). Дорожки 2, 3, 5, 6 и 7 показывают картину полос гомозиготного генотипа дикого типа (GG или 287Arg / 287Arg), который представляет собой три полосы на 240–236, 150 и 50 п.н. Дорожка 1 содержит две полосы, 240–236 и 200 п.н., представляющие картину полос гомозиготного полиморфного генотипа (AA или 287Gln / 287Gln).Дорожка 4 показывает картину полос гетерозиготного генотипа (GA или 287Arg / 287Gln), который состоит из четырех полос, на 240–236, 200, 150 и 50 п.н., как и ожидалось.

Статистический анализ

Тест Колмогорова-Смирнова использовался для проверки нормальности распределения непрерывных переменных (возраст, общий холестерин, триглицериды, холестерин ЛПНП, холестерин ЛПВП). Различия для непрерывных данных, которые следовали за нормальным распределением (общий холестерин, триглицериды, ЛПНП-холестерин, ЛПВП-холестерин) между пациентами и контрольной группой, анализировали с использованием независимого образца t -тест.Непрерывные данные, которые не соответствовали нормальному распределению (возрасту), сравнивались с использованием критерия Манна-Уитни U . Категориальные переменные, такие как пол, гипертония, статус курения, диабет и ожирение, были выражены в виде пропорций и сравнивались с использованием критерия хи-квадрат. Сравнение распределения генотипов и частот аллелей оценивали по статистике хи-квадрат Пирсона с 2 и 1 df соответственно. Точный тест Фишера использовался для вычисления значений P , когда ожидаемые значения в любой из ячеек таблицы непредвиденных обстоятельств были ≤5.Отклонение от равновесия Харди – Вайнберга оценивалось с помощью критерия хи-квадрат. Логистический регрессионный анализ с обратным отбором был использован для исследования влияния факторов риска сосудов, возраста, пола, липидных параметров и генотипов на ишемический инсульт в этой турецкой популяции. Двусторонние значения вероятности с 95% доверительными интервалами (ДИ) использовались при оценке отношения шансов (OR). Калибровка анализа логистической регрессии проводилась с помощью критерия согласия Хосмера – Лемешоу.Значение P менее 0,05 было оценено как статистически значимое, если не указано иное. Пороговый уровень значимости был скорректирован на α / n с использованием поправки Бонферрони для множественного тестирования. Эти статистические анализы были выполнены с использованием программного пакета SPSS 18.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). Расчет мощности для проверки достаточности размера выборки проводился с использованием программного обеспечения G Power 3.1. Значение мощности> 50% считалось адекватным.

Результаты

Демографические характеристики, распространенность обычных факторов риска и уровни липидов сыворотки в исследуемой популяции представлены в таблице 1.Возраст исследуемой популяции варьировал от 20 до 81 года в группе инсульта и от 39 до 90 лет в контрольной группе. Существенных различий между группами пациентов и контрольной группой по возрасту не было. Мы также оценили возрастной диапазон отдельно у мужчин и женщин. В мужской популяции возраст варьировался от 20 до 81 года для пациентов с инсультом и от 42 до 87 лет в контрольной группе, и не было существенной разницы в среднем возрасте пациентов с инсультом и мужчин в контрольной группе.С другой стороны, в женской популяции возраст пациентов с инсультом составлял от 31 до 81 года, а в контрольной группе — от 41 до 90 лет; средний возраст был значительно выше у пациенток с инсультом по сравнению с женщинами контрольной группы ( P = 0,014). Было обнаружено, что общепринятые факторы риска, а именно мужской пол, артериальная гипертензия, диабет, статус курения и ожирение, значительно более распространены в группе ишемического инсульта. Кроме того, уровни общего холестерина и холестерина ЛПНП были заметно выше, в то время как уровень холестерина ЛПВП был значительно ниже у пациентов с ишемическим инсультом по сравнению с контрольной группой.

Таблица 1 Влияние демографических характеристик, обычных факторов риска и клинических характеристик на риск ишемического инсульта

Распределение частот генотипов Tyr113His ( EPHX1 ), His139Arg ( EPHX1 ) и Arg287Gln ( EPHX2 ) и их соответствующих аллелей у пациентов с ишемическим инсультом и контрольной группы показано в таблицах 2, 3 и 4. Не было отклонений частот генотипов от равновесия Харди – Вайнберга.Мы заметили, что не было значительных различий между пациентами с ишемическим инсультом и контрольной группой с точки зрения распределения генотипов и частот минорных аллелей для любого из трех проанализированных генетических полиморфизмов. Частоты генотипов и аллелей также рассчитывались отдельно для мужских и женских субпопуляций (таблицы 2–4). Распределение генотипов и аллелей полиморфизма EPHX2 и Arg287Gln достоверно различалось в субпопуляции самок (таблица 4).

Таблица 2 Распределение генотипов и частот аллелей для EPHX1 Tyr113His (rs1051740 T> C) Полиморфизм у пациентов с ишемическим инсультом и контрольной группы

Таблица 3 Распределение генотипов и частот аллелей для EPHX1 His139Arg (rs2234922A> G) Полиморфизм у пациентов с ишемическим инсультом и контрольной группы

Таблица 4 Распределение генотипов и частот аллелей для EPHX2 Arg287Gln (rs751141G> a) Полиморфизм у пациентов с ишемическим инсультом и контрольной группы

Был проведен стратификационный анализ, чтобы определить, изменяют ли полиморфные аллели общепринятый риск ишемического инсульта, связанный с факторами риска (таблица 5).Для полиморфизма EPHX1 Tyr113His в группе гомозиготного генотипа дикого типа (TT) OR для ишемического инсульта был рассчитан как 3,21 (<0,001) для субъектов с гипертензией по сравнению с субъектами с нормальным давлением. Это значение снизилось до 2,37 (<0,001), когда присутствовал хотя бы один мутантный аллель (генотип 113TC или CC). Аналогичным образом, риск ишемического инсульта у субъектов с гипертензией по сравнению с субъектами с нормальным АД составлял 3,15, когда у них был генотип AA для полиморфизма EPHX1 и His139Arg, и этот риск снизился до 2.14 у лиц с генотипом AG или GG. EPHX2 Генетический полиморфизм Arg287Gln также влияет на риск ишемического инсульта, связанный с гипертензией. На этот раз OR увеличился с 2,52 (у индивидов дикого типа с генотипом GG) до 4,69 (у индивидов, имеющих хотя бы один аллель А). Когда был проведен стратификационный анализ в отношении наличия или отсутствия диабета, наблюдалась тенденция, аналогичная наблюдаемой в случае гипертонии. Полиморфизм EPHX1 немного снижал риск ишемического инсульта, ассоциированного с диабетом, а полиморфизм EPHX2 увеличивал риск (Таблица 5).

Таблица 5 Стратификационный анализ общепринятых факторов риска, гипертонии и диабета по разным группам генотипов EPHX1 и EPHX2 с точки зрения риска ишемического инсульта

Следующие параметры были протестированы с помощью логистического регрессионного анализа с использованием обратного отбора для определения факторов риска ишемического инсульта: возраст, пол, диабет, гипертония, ожирение, курение, концентрация общего холестерина, холестерина ЛПНП, холестерина ЛПВП. и триглицерид, а также генотипы SNP EPHX, Tyr113His, EPHX1, His139Arg и EPHX2, Arg287Gln.Результаты выявили гипертензию (OR = 3,19, 95% CI = 1,92–5,30, P <0,001) и курение (OR = 3,46, 95% CI = 1,66–7,21, P <0,001) как наиболее сильные детерминанты ишемии. Инсульт. ЛПНП-холестерин (OR = 1,46, 95% CI = 1,12–1,89, P <0,001) также был явно связан с этим заболеванием. Кроме того, ЛПВП-холестерин (OR = 0,27, 95% CI = 0,11–0,65, P <0,001) оказал защитное действие против ишемического инсульта. Тест согласия Хосмера – Лемешоу показал, что калибровка модели была удовлетворительной (хи-квадрат = 6.721, с 8 степенями свободы, P = 0,567) для логистической регрессии, и модель правильно предсказала 73,1% случаев.

Обсуждение

Распространенность инсульта составляет около 3% взрослого населения США, 33 и растет во всем мире по мере старения населения. 34 В Турции распространенность составляет от 0,9% до 4,1% среди взрослых в возрасте 45 лет и старше. 35,36 Кроме того, инсульт — самое важное состояние, приводящее к инвалидности у пожилых людей.Поэтому важно собрать как можно больше информации о генетических детерминантах инсульта. Ишемический инсульт составляет около 80% всех случаев; 33 Таким образом, в этом исследовании мы стремились изучить возможную связь вариации EPHX2 Arg287Gln и вариаций EPHX1, Tyr113His и His139Arg с риском ишемического инсульта в турецкой популяции. Результаты показывают, что нет значительной связи между этими генетическими полиморфизмами и риском ишемического инсульта.

Фермент

sEH расщепляет EET на DHET, которые считаются неактивными или менее активными. Однако позже было показано, что они оказывают сосудорасширяющее действие на коронарные артериолы и артерии. 37,38 Кроме того, было показано, что DHET проявляют противовоспалительные свойства. 39 Следовательно, как EET, так и их метаболиты DHET могут быть важными регуляторами коронарного кровообращения. In vitro было показано, что EPHX2 Arg287Gln вызывает снижение активности sEH (25–58% от активности фермента дикого типа). 16 Это может объяснить наш вывод об отсутствии связи между аллелем EPHX2 287Gln и риском ишемического инсульта.

Более того, образование EET посредством эпоксигенации арахидоновой кислоты регулируется высокополиморфным классом ферментов, цитохромом P450 (CYP). Сообщалось, что по крайней мере 12 генов CYP человека обладают эпоксигеназной активностью, включая семейства CYP1A. 40 Ранее мы показали, что варианты гена CYP1A1 были значительно связаны с риском ишемического инсульта, особенно в подгруппах. 27 Следовательно, ожидается, что комбинация полиморфизмов CYP1A1 и EPHX2 у данного человека будет иметь большее влияние на управление риском ишемического инсульта или защиту.

После этой информации неудивительно, что в литературе имеются полностью противоречивые сообщения о взаимосвязи между вариантом EPHX2, Arg287Gln и риском сердечно-сосудистых заболеваний. Было обнаружено, что аллель 287Gln оказывает защитное действие против ишемического повреждения нейронов на модели крыс. 17 Точно так же он был связан со значительно более низким риском ишемического инсульта у населения Китая. 25 Напротив, в других исследованиях было обнаружено, что этот вариант связан с повышенным риском ишемической болезни сердца. 20,22,23 Кроме того, он был связан с кальцифицированными бляшками сонной артерии в семьях европейцев Америки 41 и с повышенным риском ишемического инсульта (OR = 1,458, P = 0,005) у белых европейцев. 24 Однако в крупном когортном исследовании в датской популяции не было обнаружено значительной связи между аллелем EPHX2 287Gln и ишемическим инсультом. 42 Аналогичным образом, пять полиморфизмов EPHX2 , включая 287Gln, не показали значительной связи с ишемическим инсультом в большой выборке белых и афроамериканцев. 21 Значимые отношения были обнаружены с гаплотипами; однако эффекты гаплотипов были противоположными. 21

Другое возможное объяснение этих расхождений исходит из работы Ramirez et al, 43 , который сообщил, что не было существенной связи между генотипом EPHX2 Arg287Gln и либо концентрациями EET, либо активностью sEH, и предположил, что повышение Аллельная экспрессия у гетерозигот могла компенсировать менее активный аллель. 43 Известно, что курение сигарет увеличивает экспрессию гена EPHX2 , 23 , что может компенсировать снижение активности фермента, вызванное полиморфизмом Arg287Gln.Таким образом, можно объяснить результат, полученный в настоящем исследовании, наличием большего количества курильщиков среди носителей аллеля 287Gln (A); курильщики составляли 25% субъектов с генотипом GA или AA и 20,9% субъектов с генотипом GG. Следовательно, защита, которая могла быть обеспечена аллелем с низкой активностью Gln287 (A), нивелируется большим количеством курильщиков в этой подгруппе, что, вероятно, усиливает sEH.

Функции sEH связаны с регуляцией сосудистого тонуса из-за его роли в метаболизме EET.Поэтому мы провели стратификационный анализ, основанный на наличии гипертонии, и обнаружили, что наличие 287Gln генетической вариации в EPHX2 увеличивает риск связанного с гипертензией ишемического инсульта с 2,52 до 4,69. Мы также выполнили стратификацию на основе наличия диабета, поскольку сообщалось, что транскрипция гена EPHX2 подавляется в условиях высокого уровня глюкозы. 44 В этом анализе полиморфизм EPHX2 увеличивал риск ишемического инсульта, связанного с диабетом.Ohtoshi et al. Обнаружили, что инсулинорезистентность была значительно увеличена у пациентов с диабетом II типа с аллелем 287Gln. 45 Сложное взаимодействие между ксенобиотиками, такими как химические вещества, связанные с сигаретным дымом, индукцией генов и физиологическими состояниями, такими как диабет, может объяснить эти результаты.

Функции мЭГ могут иметь потенциально противоположные эффекты на риск ишемического инсульта. Этот фермент играет роль в метаболизме как EET 7 , так и ПАУ. Его способность превращать ПАУ в менее реактивные виды делает мЭГ защитным средством от атеросклероза, который является значительным фактором риска, приводящим к ишемическому инсульту.В этом исследовании два функциональных SNP, Tyr113His и His139Arg, в гене EPHX1 были проанализированы в отношении риска ишемического инсульта. Вариация Tyr113His приводит к снижению активности фермента mEH на 39%, тогда как вариация His139Arg вызывает повышение активности фермента на 25%. 8 Наши результаты свидетельствуют об отсутствии связи между минорными аллелями и статусом заболевания в исследуемой группе.

Никакие предыдущие исследования не анализировали генетический полиморфизм EPHX1 и ассоциацию ишемического инсульта, а исследования, проведенные на различных видах рака, сообщили о противоречивых результатах.Чтобы упомянуть некоторые из этих исследований, было обнаружено, что генетические полиморфизмы EPHX1 являются важными факторами риска для восприимчивости к различным видам рака, включая рак простаты, 9,10 , рак легких 12 и острый лимфобластный лейкоз. 11 Было показано, что аллель 113His является фактором риска карциномы легких у азиатов, тогда как в недавнем метаанализе было обнаружено, что он оказывает защитный эффект у кавказцев. 46 Более того, низкая активность мЭГ приписывается защитной роли против детской лимфобластной лейкемии. 47 Кроме того, метаанализ продемонстрировал тенденцию к защитному эффекту His139Arg SNP против риска колоректального рака. 48 Очевидно, что результаты значительно различаются среди разных популяций.

Вариантные аллели EPHX1 (113His и 139Arg), как было обнаружено, снижают восприимчивость к инсульту в стратификационном анализе в этом исследовании. Мы наблюдали более низкий риск ишемического инсульта, связанного с гипертензией, у субъектов, несущих хотя бы один аллель 113His (OR = 2.37) по сравнению с людьми с генотипом дикого типа (OR = 3,21). Поскольку EET выполняют важные функции в регулировании сосудистого тонуса и церебрального кровотока, эффект этого аллеля, который снижает скорость метаболизма EET, мог бы стать очевидным при стратификационном анализе, основанном на гипертонии. Риск связанного с диабетом ишемического инсульта также был ниже у носителей аллеля 113His (OR = 2,09) по сравнению с субъектами с генотипом дикого типа (OR = 2,19).

В этом исследовании также было замечено, что OR для ишемического инсульта, связанного с гипертензией, снизился с 3.От 15 до 2,14, когда присутствовал хотя бы один аллель EPHX1 139Arg. Было обнаружено, что этот аллель увеличивает активность фермента mEH; 49 следовательно, скорость атерогенного химического метаболизма могла быть увеличена у субъектов, обладающих этим аллелем. Связь между сахарным диабетом и атеросклерозом хорошо известна; следовательно, сахарный диабет в несколько раз увеличивает риск инсульта. 50 EPHX1 His139 / His139 носители генотипа показали более высокий уровень инсулина натощак и более низкую чувствительность к инсулину по сравнению с носителями аллеля Arg139 ( P = 0.020 и P = 0,001 соответственно), 51 , что может означать, что диабетические осложнения менее тяжелы у носителей аллеля 139Arg. В этом исследовании аллель 139Arg снижал риск ишемического инсульта, связанного с диабетом, в стратификационном анализе.

Гипертония, курение и холестерин ЛПНП оказались значительными факторами риска, а холестерин ЛПВП оказался защитным фактором для возникновения ишемического инсульта с помощью логистического регрессионного анализа, что также было обнаружено в наших предыдущих исследованиях. 27,28 Однако наше исследование имело ограничение в отношении размера выборки здоровых контрольных субъектов, вызванное возрастными ограничениями при выборе контрольных субъектов. Тем не менее, результат теста мощности был удовлетворительным; поэтому результаты считались статистически достоверными.

Хорошо известно, что распределение аллелей для данного генетического варианта может заметно различаться между популяциями. Таким образом, мы включили сравнение частот минорных аллелей для вариантов EPHX1, Tyr113His (rs1051740 T> C), EPHX1, His139Arg (rs2234922 A> G) и EPHX2 Arg287Gln (rs751141 G> A) в здоровой контрольной популяции. этого исследования с пациентами из различных контрольных популяций, которые были проанализированы ранее (Таблица 6). EPHX1 rs1051740 Аллель C (113His) наблюдался с частотой 0,31 в нашем исследовании, и эта частота варьировалась от 0,25 11 до 0,35 52 в других исследованиях, которые также проводились на турецкой популяции. 11,52–55 Частота аллеля 113His была самой низкой у индейцев (0,23) 56 и самой высокой у тайваньцев (0,48) 57 среди других популяций 32,51,56–64 (таблица 6). Наблюдалась частота аллеля EPHX1 rs2234922 G (139Arg), равная 0.19 в нашем исследовании, что было точно таким же, как и у Сахина и др. 55 , и было близко к этому значению в других исследованиях, проведенных на турецком населении. 11,52–54 Частота этого аллеля была определена в нескольких других популяциях 32,51,56–64 и наблюдалась с наименьшим значением (0,09) в популяции Китая 59 и с наибольшим значением (0,41 ) в африканской популяции. 64 Относительно немного исследований в литературе было выполнено по полиморфизму EPHX2 Arg287Gln (Таблица 6).Было обнаружено, что частота минорного аллеля rs751141A составляет 0,09 в нашей популяции, и никаких других исследований на турецкой популяции не проводилось. Частота аллеля rs751141A находилась в диапазоне от 0,08, который был обнаружен у белых европейцев, 24 до 0,21, который был обнаружен в популяции Японии, 45 среди других популяций. 20,21,23,24,45

Таблица 6 EPHX1 Tyr113His (rs1051740 T> C), EPHX1 His139Arg (rs2234922 A> G) и EPHX2 Arg287Gln (Rs751141 G> A) Вспомогательные репрезентативные популяции с 9000 частотами

В заключение, насколько нам известно, впервые проанализирована связь генетических полиморфизмов EPHX1 с риском ишемического инсульта.Хотя EPHX1 вариантных аллелей не были существенно связаны с риском ишемического инсульта в общей группе исследования, наличие по крайней мере одного аллеля 113His или 139Arg снижало риск ишемического инсульта, связанного с гипертензией или диабетом, в подгруппах. Кроме того, в этой работе впервые была исследована связь полиморфизма Arg287Gln из EPHX2 и риска ишемического инсульта в турецкой популяции, и результаты показали, что полиморфный аллель не был существенно связан с ишемическим инсультом.Однако вариантный аллель EPHX2 увеличивал риск связанного с гипертензией и диабетом ишемического инсульта в анализе подгрупп. Таким образом, сочетание различного генетического фона с общепринятыми факторами риска может значительно изменить риск ишемического инсульта.

Благодарности

Авторы благодарят субъектов за участие в этом исследовании и профессора доктора Шерефа Демиркая за сбор образцов. Это исследование не получало каких-либо конкретных грантов от финансирующих агентств в государственном, коммерческом или некоммерческом секторах.

Раскрытие

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.

Список литературы

1. Катан М., Люфт А. Глобальное бремя инсульта. Семин Нейрол . 2018; 38 (2): 208–211. DOI: 10.1055 / с-0038-1649503

2. Нагай Ю., Китагава К., Сакагучи М. и др. Значимость ранее перенесенного атеросклероза сонных артерий для подтипов инсульта. Ход . 2001; 32: 1780–1785. DOI: 10.1161 / 01.STR.32.8.1780

3. Либби П., Бьюринг Дж. Э., Бадимон Л. и др.Атеросклероз. Натр Рев Дис Праймеры . 2019; 5: 56. DOI: 10.1038 / s41572-019-0106-z

4. Судхахар В., Шоу С., Имиг Дж. Д.. Аналоги эпоксиэйкозатриеновой кислоты и функция сосудов. Курр Мед Хим . 2010. 17 (12): 1181–1190. DOI: 10.2174 / 0929867107843

5. Де Флора С., Иззотти А., Уолш Д. и др. Молекулярная эпидемиология атеросклероза. FASEB J . 1997; 11: 1021–1031. DOI: 10.1096 / fasebj.11.12.9337155

6. Penn A, Snyder C. Развитию артериосклеротических бляшек «способствуют» полиядерные ароматические углеводороды. Канцерогенез . 1988; 9: 2185–2189. DOI: 10.1093 / carcin / 9.12.2185

7. Маровски А., Бургенер Дж., Фальк Дж. Р. и др. Распределение растворимой и микросомальной эпоксидгидролазы в мозге мышей и ее вклад в метаболизм церебральной эпоксиэйкозатриеновой кислоты. Неврология . 2009. 163 (2): 646–661. DOI: 10.1016 / j.neuroscience.2009.06.033

8. Хассет С., Робинсон К. Б., Бек Н. Б., Омецински С. Дж.. Ген микросомальной эпоксидгидролазы человека (EPHX1): полная нуклеотидная последовательность и структурная характеристика. Геномика . 1994; 23: 433–442. DOI: 10.1006 / geno.1994.1520

9. Фигер А., Фридман Т., Мангуоглу А.Е. и др. Анализ полиморфных паттернов в генах-кандидатах у израильских пациентов с раком простаты. Иср Мед Ассо Дж. . 2003; 5: 741–745.

10. Миттал Р.Д., Шривастава Д.С. Полиморфизм генов цитохрома P4501A1 и микросомальной эпоксидгидролазы: взаимодействие гена и окружающей среды и риск рака простаты. ДНК клетки биол . 2007; 26: 791–798. DOI: 10,1089 / днк.2007.0630

11. Tumer TB, Sahin G, Arinç E. Ассоциация между полиморфизмами генов EPHX1 и XRCC1 и риском острого лимфобластного лейкоза у детей. Арк Токсикол . 2012; 86: 431–439. DOI: 10.1007 / s00204-011-0760-8

12. Zhang P, Zhang Y, Yang H, et al. Связь между EPHX1 rs1051740 и восприимчивостью к раку легких: метаанализ. Инт Дж. Клин Эксперт Мед. . 2015; 8 (10): 17941–17949.

13. Beetham JK, Tian T, Hammock BD. Клонирование кДНК и экспрессия растворимой эпоксидгидролазы из печени человека. Арч Биохим Биофиз . 1993. 305 (1): 197–201. DOI: 10.1006 / abbi.1993.1411

14. Ларссон С., Уайт И., Йоханссон С. и др. Локализация гена растворимой эпоксидгидролазы человека (EPHX2) в хромосомной области 8p21-p12. Хум Генет . 1995. 95 (3): 356–358. DOI: 10.1007 / BF00225209

15. Imig JD, Hammock BD. Растворимая эпоксидгидролаза как терапевтическая мишень при сердечно-сосудистых заболеваниях. Нат Рев Лекарство Дисков . 2009. 8 (10): 794–805. DOI: 10.1038 / nrd2875

16.Przybyla-Zawislak BD, Srivastava PK, Vazquez-Matias J, et al. Полиморфизмы растворимой эпоксидгидролазы человека. Мол Фармакол . 2003. 64 (2): 482–490. DOI: 10.1124 / mol.64.2.482

17. Koerner IP, Jacks R, DeBarber AE, et al. Полиморфизм гена растворимой эпоксидгидролазы человека EPHX2 связан с выживаемостью нейронов после ишемического повреждения. Дж. Neurosci . 2007; 27: 4642–4649. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.0056-07.2007

18. Чжан В., Кернер И.П., Ноппенс Р. и др. Растворимая эпоксидгидролаза: новая терапевтическая мишень при инсульте. J Метаб кровотока Цереб . 2007; 27: 1931–1940. DOI: 10.1038 / sj.jcbfm.9600494

19. Чжан В., Оцука Т., Суго Н. и др. Делеция гена растворимой эпоксидгидролазы защищает от экспериментальной церебральной ишемии. Ход . 2008; 39: 2073–2078. DOI: 10.1161 / STROKEAHA.107.508325

20. Форнаж М., Бурвинкл Э., Дорис П.А. и др. Полиморфизм растворимой эпоксидгидролазы связан с кальцификацией коронарных артерий у афроамериканцев: исследование развития риска коронарных артерий у молодых людей (CARDIA). Тираж . 2004. 109 (3): 335–339. DOI: 10.1161 / 01.CIR.0000109487.46725.02

21. Fornage M, Lee CR, Doris PA, et al. Ген растворимой эпоксидгидролазы содержит вариации последовательности, связанные с предрасположенностью к ишемическому инсульту и защитой от него. Хум Мол Генет . 2005; 14: 2829–2837. DOI: 10.1093 / hmg / ddi315

22. Lee CR, North KE, Bray MS, et al. Генетическая изменчивость растворимой эпоксидгидролазы (EPHX2) и риск ишемической болезни сердца: исследование риска атеросклероза в сообществах (ARIC). Хум Мол Генет . 2006; 15: 1640–1649. DOI: 10.1093 / hmg / ddl085

23. Wei Q, Doris PA, Pollizotto MV, et al. Вариация последовательности гена растворимой эпоксидгидролазы и субклинический коронарный атеросклероз: взаимодействие с курением сигарет. Атеросклероз . 2007; 190: 26–34. DOI: 10.1016 / j.atherosclerosis.2006.02.021

24. Гшвендтнер А., Рипке С., Фрейлингер Т. и др. Генетическая изменчивость растворимой эпоксидгидролазы (EPHX2) связана с повышенным риском ишемического инсульта у белых европейцев. Ход . 2008; 39: 1593–1596. DOI: 10.1161 / STROKEAHA.107.502179

25. Zhang L, Ding H, Yan J, et al. Генетическая изменчивость цитохрома P450 2J2 и растворимой эпоксидгидролазы и риск ишемического инсульта у населения Китая. Фармакогенет Геномика . 2008; 18: 45–51. DOI: 10.1097 / FPC.0b013e3282f313e8

26. Всемирная медицинская ассоциация. Хельсинкская декларация: этические принципы медицинских исследований с участием людей. ЯМА . 2013. 310 (20): 2191–2194.DOI: 10.1001 / jama.2013.281053

27. Demirdöen BC, Adali AÇ, Bek S, et al. Генотипы цитохрома P4501A1 и риск ишемического инсульта, связанный с курением и гипертензией. Хам Эксп Токсикол . 2013. 32 (5): 483–491. DOI: 10.1177 / 0960327112464667

28. Türkanolu Özçelik A, Can Demirdöen B, Demirkaya Ş, et al. Ассоциация цитохрома P4502E1 и NAD (P) H: генетический полиморфизм хиноноксидоредуктазы 1 с восприимчивостью к атеросклеротическому ишемическому инсульту крупных артерий: исследование случай-контроль в турецкой популяции. Neurol Sci . 2017; 38 (6): 1077–1085. DOI: 10.1007 / s10072-017-2930-9

29. Лахири Д.К., Шнабель Б. Выделение ДНК быстрым методом из образцов крови человека: влияние MgCI 2 , ЭДТА, времени хранения и температуры на выход и качество ДНК. Биохимия Генет . 1993; 31: 321–328. DOI: 10.1007 / BF00553174

30. Корхонен С., Ромппанен Э.Л., Хилтунен М. и др. Два экзонных однонуклеотидных полиморфизма в гене микросомальной эпоксидгидролазы связаны с синдромом поликистозных яичников. Фертил Стерил . 2003. 79 (6): 1353–1357. DOI: 10.1016 / S0015-0282 (03) 00385-6

31. Доступно по адресу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. По состоянию на 20 декабря 2019 г.

32. Смит, Калифорния, Харрисон ди-джей. Связь между полиморфизмом гена микросомальной эпоксидгидролазы и восприимчивостью к эмфиземе. Ланцет . 1997; 350: 630–633. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (96) 08061-0

33. Ovbiagele B, Nguyen-Huynh MN. Эпидемиология инсульта: улучшение нашего понимания механизма заболевания и лечения. Нейротерапия . 2011. 8 (3): 319–329. DOI: 10.1007 / s13311-011-0053-1

34. Фейгин В.Л., Кришнамурти Р.В., Пармар П. и др. Обновленная информация о глобальном бремени ишемического и геморрагического инсульта в 1990–2013 гг .: исследование ГББ 2013 г. Нейроэпидемиология . 2015; 45: 161–176. DOI: 10.1159 / 000441085

35. Öncel Ç, Tokgöz F, Bozkurt AI, Erdoan. Распространенность цереброваскулярных заболеваний: поквартирный опрос в Западной Анатолии. Neurol Sci . 2014. 35 (3): 373–377. DOI: 10.1007 / с10072-013-1521-7

36. Padir Şensöz N, Türk Börü Ü, Bölük C, et al. Эпидемиология инсульта в городе Карабюк, Турция: исследование на уровне сообществ. eNeurologicalSci . 2017; 10: 12–15. DOI: 10.1016 / j.ensci.2017.12.003

37. Oltman CL, Weintraub NL, VanRollins M, et al. Эпоксиэйкозатриеновые кислоты и дигидроксиэйкозатриеновые кислоты являются сильнодействующими вазодилататорами коронарной микроциркуляции у собак. Circ Res . 1998; 83: 932–939. DOI: 10.1161 / 01.RES.83.9.932

38.Ларсен Б.Т., Миура Х., Хатум О.А. и др. Эпоксиэйкозатриеновая и дигидроксиэйкозатриеновая кислоты расширяют коронарные артериолы человека через каналы BKCa: последствия для ингибирования растворимой эпоксидгидролазы. Am J Physiol Heart Circ Physiol . 2006; 290 (2): h591 – h599. DOI: 10.1152 / ajpheart.00927.2005

39. Узел К, Хо Й, Руан Х и др. Противовоспалительные свойства эйкозаноидов, полученных из эпоксигеназы цитохрома Р450. Наука . 1999. 285 (5431): 1276–1279. DOI: 10.1126 / science.285.5431.1276

40. Шварц Д., Киселев П., Эриксен С.С. и др. Метаболизм арахидоновой и эйкозапентаеновой кислоты человеческим CYP1A1: высокостереоселективное образование 17 (r), 18 (s) -эпоксиэйкозатетраеновой кислоты. Биохим Фармакол . 2004. 67: 1445–1457. DOI: 10.1016 / j.bcp.2003.12.023

41. Burdon KP, Lehtinen AB, Langefeld CD, et al. Генетический анализ гена растворимой эпоксидгидролазы EPHX2 при субклинических сердечно-сосудистых заболеваниях в исследовании Diabetes Heart Study. Диаб Васк Дис Рез. .2008. 5 (2): 128–134. DOI: 10.3132 / dvdr.2008.021

42. Ли Дж., Даль М., Гранде П., Тибьярг-Хансен А., Нордестгаард Б.Г. Генетически сниженная активность растворимой эпоксидгидролазы и риск инсульта и других сердечно-сосудистых заболеваний. Ход . 2010. 41 (1): 27–33. DOI: 10.1161 / STROKEAHA.109.567768

43. Ramirez CE, Shuey MM, Milne GL, et al. Arg287Gln вариант EPHX2 и эпоксиэйкозатриеновые кислоты связаны с чувствительностью к инсулину у людей. Простагландины Другой липидный препарат .2014; 113–115: 38–44. DOI: 10.1016 / j.prostaglandins.2014.08.001

44. Огуро А., Оида С., Имаока С. Снижение регуляции транскрипции гена EPHX2 с помощью Sp1 в условиях высокого уровня глюкозы. Биохимия J . 2015; 470 (3): 281–291. DOI: 10.1042 / BJ20150397

45. Охтоши К., Кането Х., Узел К. и др. Связь полиморфизма гена растворимой эпоксидгидролазы с инсулинорезистентностью у больных сахарным диабетом 2 типа. Биохимия Биофиз Рес Коммуна . 2005; 331: 347–350. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2005.03.171

46. Tan X, Wang YY, Chen XY, et al. Количественная оценка эффектов полиморфизма Tyr113His EPHX1 на рак легких и молочной железы. Генет Мол Рес . 2014; 13: 7437–7446. DOI: 10.4238 / 2014.September.12.10

47. Silveira Vda S, Canalle R, Scrideli CA, et al. Роль генов CYP2D6, EPHX1, MPO и NQO1 в предрасположенности к острому лимфобластному лейкозу у детей Бразилии. Энвирон Мол Мутаген . 2010; 51: 48–56. DOI: 10.1002 / em.20510

48.Лю Ф, Юань Д., Вэй Й и др. Систематический обзор и метаанализ взаимосвязи между полиморфизмами EPHX1 и риском колоректального рака. PLoS Один . 2012; 7: e43821. DOI: 10.1371 / journal.pone.0043821

49. Hassett C, Aicher L., Sidhu JS, et al. Эпоксидгидролаза микросом человека: генетический полиморфизм и функциональная экспрессия in vitro вариантов аминокислот. Хум Мол Генет . 1994. 3 (3): 421–428. DOI: 10.1093 / hmg / 3.3.421

50. Бруно А., Либескинд Д., Хао К. и др.; для исследователей инсульта UCLA. Сахарный диабет, острая гипергликемия и ишемический инсульт. Варианты лечения Curr в Neurol . 2010. 12 (6): 492–503. DOI: 10.1007 / s11940-010-0093-6

51. Ghattas MH, Amer MA. Возможная роль полиморфизма гена микросомальной эпоксидгидролазы как фактора риска развития инсулинорезистентности и сахарного диабета 2 типа. Эндокринная . 2012. 42 (3): 577–583. DOI: 10.1007 / s12020-012-9656-5

52. Пинарбаси Э., Перчин ИП, Йилмаз М., Акгун Э., Цетин М., Цетин А.Ассоциация полиморфизма гена микросомальной эпоксидгидролазы и преэклампсии у турецких женщин. J Obstet Gynaecol Res . 2007; 33: 32–37. DOI: 10.1111 / j.1447-0756.2007.00473.x

53. Ада А.О., Сюзен Х.С., Искан М. Полиморфизмы микросомальной эпоксидгидролазы и глутатион-S-трансферазы P1 в турецкой популяции мужского пола. Инт Дж. Токсикол . 2007; 26: 41–46. DOI: 10.1080 / 10

0601118222

54. Pinarbasi H, Silig Y, Pinarbasi E. Полиморфизмы микросомальной эпоксидгидролазы. Мол Мед Репа . 2010. 3 (4): 723–727. DOI: 10.3892 / mmr_00000324

55. Сахин О., Арикан С., Мустери Олтулу Й. и др. Исследование возможной взаимосвязи между полиморфизмом гена EPHX1 и колоректальным раком в турецком обществе. Генет Тест Мол Биомаркеры . 2012. 16 (5): 423–428. DOI: 10.1089 / gtmb.2011.0223

56. Наби С., Бхат Г.А., Икбал Б. и др. Ассоциация изменяющих активность генотипов Tyr113His и His139Arg в микросомальном ферменте эпоксидгидролазы с плоскоклеточной карциномой пищевода. Натр Рак . 2019; 71 (5): 806–817. DOI: 10.1080 / 01635581.2018.1484934

57. Cheng SL, Yu CJ, Chen CJ, Yang PC. Генетический полиморфизм эпоксидгидролазы и глутатион-S-трансферазы при ХОБЛ. Евро Респир J . 2004; 23: 818–824. DOI: 10.1183 / 036.04.00104904

58. Yoshikawa M, Hiyama K, Ishioka S, Maeda H, Maeda A, Yamakido M. Генотипы микросомальной эпоксидгидролазы и хроническая обструктивная болезнь легких на японском языке. Инт Дж Мол Меди . 2000; 5: 49–53.DOI: 10.3892 / ijmm.5.1.49

59. Xiao D, Wang C, Du MJ, et al. Связь полиморфизма генов, кодирующих микросомальную эпоксидгидролазу и глутатион-S-трансферазу P1, и хроническую обструктивную болезнь легких. Чин Мед Дж. . 2004. 117: 661–667.

60. Harms C, Salama SA, Sierra-Torres CH, Cajas-Salazar N, Au WW. Полиморфизмы генов репарации ДНК, хромосомные аберрации и рак легких. Энвирон Мол Мутаген . 2004. 44 (1): 74–82. DOI: 10.1002 / em.20031

61.Клавель Дж., Беллек С., Ребуиссу С. и др. Детский лейкоз, полиморфизмы генов ферментов метаболизма и взаимодействие с материнским табаком, кофе и алкоголем во время беременности. евро J Cancer Предыдущий . 2005; 14: 531–540. DOI: 10.1097 / 00008469-200512000-00007

62. Гошал У., Кумар С., Джайсвал В., Трипати С., Миттал Б., Гошал, Калифорния. Ассоциация микросомальных полиморфизмов Tyr113His экзона 3 эпоксидгидролазы и His139Arg экзона 4 с раком желудка в Индии. Индийский Дж. Гастроэнтерол .2013. 32 (4): 246–252. DOI: 10.1007 / s12664-013-0332-3

63. Fernandes GMM, Russo A, Proença MA, et al. Полиморфизмы CYP1A1, CYP2E1 и EPHX1 при спорадических колоректальных новообразованиях. Мир Дж. Гастроэнтерол . 2016; 22 (45): 9974–9983. DOI: 10.3748 / wjg.v22.i45.9974

64. Найду П., Найду Р. Н., Рамкаран П., Ашарам К., Чутургун А. А.. Tyr113His T / C и очень медленный фенотип гена EPHX1 изменяют экспрессию miR-26b-5p и miR-1207-5p во время беременности. Ген . 2017; 633: 71–81.DOI: 10.1016 / j.gene.2017.07.080

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *